气单胞菌属细菌的黑色素形成分子机制及相关生物学功能的进一步研究

In previous time, it is generally believed that Aeromonas bacteria should produce eumelanin via L-DOPA pathway, since the characteristic intermediate L-DOPA could be detected from the culture fluids of several melanogenic Aeromonas strains. However, our recent results demonstrated that the pyomelanin produced via Homogentisate acid (HGA) pathway is actually the major pigment constituents in the melanin high-producing strain Aeromonas media WS. Such HGA pathway is ubiquitous and every gene in the pathway is functioning normally among all species in this genus, including those with phenotype of pigmented, pigmented only in low temperature, and non-pigmented, and both pathogenic or non-pathogenic Aeromonas. Therefore, the pigment synthetic regulation process in Aeromonas bacteria and its biological function are much more complex than our current knowledge. Based on our current works, we plan to conduct further research on the key transcriptional regulators relating to the pyomelanin production, the relativity between bacterial melanogenesis and pathogenicity, and whether Aeromonas bacteria could produce two kinds of melanin at the same time. The achieved results may theoretically extend our knowledge on the molecular mechanism of melanin synthesis and its biological function in bacteria, and from the application point of view, may contribute in providing new ideas and technical basis to construct high or low melanin producing microbial fermentation strains, develop new bacterial recourses for L-DOPA production, and even expand our knowledge and potential therapeutic measure on human alkaptonuria.

此前一直预测气单胞菌是通过L-DOPA途径形成真黑素，因为从多株产黑气单胞菌菌株的培养液中都能检测到特征性中间产物L-DOPA的存在。但我们的近期研究却证实， 经尿黑酸（HGA）途径形成的脓黑素才是高产黑色素的中间气单胞菌WS的主要色素成分。该HGA途径在所有产黑、仅在低温下产黑或完全不产黑，以及致病或非致病的气单胞菌中都普遍存在，且相关基因均表达正常。说明气单胞菌的黑色素合成调控过程及实际生物学效应远比我们预想的复杂。本申请拟以前期工作为基础，对气单胞菌属细菌合成脓黑素的关键调控元件、黑色素与致病性的相关性、以及该菌是否同时产生两种黑色素等问题进行进一步深入研究。研究结果将在理论上进一步扩展对细菌合成黑色素的分子机理及生物学功能的认识，在应用上则可为构建黑色素高产或弱产微生物发酵菌株，开发新的产L-DOPA菌种资源，甚至在拓展对人尿黑酸尿症的认识和治疗措施方面提供新的思路和技术基础。

项目主要获得如下主要结果：1）确定中间气单胞菌（Aeromonas media）WS菌株的M10、M13突变株无法产黑的表型是由tyrR基因突变所导致，其通过直接与phhAB操纵子及hppD基因的启动子区结合，激活phhAB和hppD的转录，对黑色素的合成起重要调控作用。2）首次证明杀鲑气单胞菌杀鲑亚种黑色素合成的温敏现象是由于HppD的热不稳定性造成。同时鉴定了三个关键氨基酸位点（S18T、P103Q和L119P）与其热不稳定性密切相关。这是首次发现杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的黑色素合成温敏性现象是HppD蛋白为适应细菌的低温生长环境而进化的结果。3）通过质谱技术首次在气单胞菌黑色素合成最终产物中鉴定了多巴黑色素单体组分，证实该菌同时存在尿黑酸黑色素和多巴黑色素二种色素，并提出气单胞菌中的混合黑色素及网络代谢调控的概念。结合蛋白质质谱技术，发现中间气单胞菌WS菌株表达两个多酚氧化酶，分别为漆酶YfiH和过氧化氢酶CAT。WS ΔyfiH的黑色素合成能力和野生菌株相比并无明显变化（约10%的下降），说明它与该菌的色素形成关系不大。但WS ΔkatE的黑色素合成不仅在产量上大幅度下降（超过50%），其合成过程相对于WS野生菌株而言也大幅度提前（从24 h提前至15 h），不过这个现象与已经证明的WS菌株以尿黑酸通路为该菌黑色素合成主要途径的结论并不完全相符。进一步的实验证实黑色素具有清除氧自由基的能力，在面对胞内氧自由基压力的时候可以部分行使CAT相关酶类的功能。因此突变株WS ΔkatE的黑色素合成过程被提前以维持胞内的ROS水平的上限，这个现象与真核生物中的相关报道一致，这是首次在原核生物中发现胞内氧自由基水平对黑色素合成的也存在调控关系。我们还发现确实CAT的WS ΔkatE 在培养过程中会因ROS造成的氧化压力提前死亡，有望开发出通过氧化压力来控制基因改造微生物细胞的程序死亡，降低遗传改造微生物释放到环境中时的生态安全风险。上述研究结果进一步扩展了人们对细菌合成黑色素的分子机理及生物学功能的认识。