猪瘟病毒衣壳蛋白核转运机制研究

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪瘟是猪的一种高发病率和高死亡率的烈性传染病。该病在猪群中的发生和流行给养殖业带来巨大经济损失。虽然对CSFV的研究日益深入，但是关于CSFV致病机理的许多方面仍然不清楚。衣壳蛋白（Capsid，C）是猪瘟病毒的主要结构蛋白，对C蛋白细胞定位前期工作表明，C蛋白定位于细胞核中，但其定位机制、转运机制以及定位的功能尚不清楚。本项目拟采用病毒感染和构建C蛋白与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合的真核表达质粒转染细胞来确定C蛋白在活细胞中的准确定位；构建C蛋白缺失和定点突变体来鉴定C蛋白的核定位信号（NLS）以及核输出信号（NES），探讨C蛋白核定位的转运机制；进一步构建NLS、NES缺失病毒，研究C蛋白的NLS和NES在病毒复制中的作用，从而为阐明C蛋白在猪瘟病毒感染中的生物学功能奠定基础。

猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是一种烈性传染病，对世界养猪业的发展具有巨大影响。通过对猪瘟病毒衣壳蛋白（Capsid，C）核仁定位信号及其生物学功能的研究将为深入阐明猪瘟病毒的致病机制提供帮助。.为了解猪瘟病毒（CSFV）衣壳蛋白（C）在细胞中的定位情况，我们将CSFV C蛋白基因克隆于真核表达载体pEGFP-C2中（pEGFP-CSFV-C）。将该重组质粒转染ST细胞，转染2 h、4 h、6 h后，利用激光共聚焦显微镜分析C表达蛋白在细胞中的定位情况。试验结果表明，CSFV 表达蛋白在ST细胞中主要定位于细胞质和核仁中。.为鉴定猪瘟病毒（CSFV）衣壳蛋白在细胞中的核仁定位信号（NoLS），本研究采用截短表达的方法，将C基因不同片段的真核表达重组质粒转染猪睾丸细胞（ST）。结果表明，瞬时表达截短衣壳蛋白的aa51-aa71多肽定位于ST细胞核仁中。C蛋白的aa51- aa71缺失突变后，衣壳蛋白蛋白则丧失了其核仁定位的能力。将衣壳蛋白的51KKK53突变为51AAA53，也同样导致衣壳蛋白丧失核仁定位能力，表明该序列为核仁定位的核心基序。本研究成功鉴定了衣壳蛋白的核仁定位信号。.宿主细胞核仁素蛋白（NCL）是核仁中的主要蛋白。衣壳蛋白可能通过与NCL蛋白的相互作用完成核仁的定位以及核仁和核质的运输。为鉴定CSFV衣壳蛋白与NCL的相互作用，本研究采用GST pull-down和Co-IP方法沉淀细胞中猪睾丸细胞（ST）中的NCL蛋白。结果表明，C蛋白与NCL蛋白在体外和转染细胞中均存在相互作用。NCL蛋白被抑制后，CSFV复制能力下降。本研究为分析C蛋白核转运机制以及在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据。C蛋白通过与NCL的相互作用实现在细胞中的核转运。.波形蛋白（Vimentin）是一种重要的中间丝骨架蛋白，在细胞黏附和移动中发挥生物学功能。本研究对波形蛋白的细胞定位进行检测并分析衣壳蛋白在细胞中的定位情况。结果表明，波形蛋白在细胞核周围定位，并且与CSFV衣壳蛋白在细胞中存在共定位现象。波形蛋白为衣壳蛋白的核转运提供平台。.通过本课题研究，达到最初预订目标：确定了C蛋白在细胞内核仁定位，核仁定位信号的关键氨基酸序列，同时C蛋白通过与NCL的相互作用在细胞中完成核穿梭。.本课题研究成果：发表相关研究论文6篇，培养硕士研究生4名。