汉滩病毒核衣壳蛋白核质转运信号的鉴定及其在病毒感染中功能的研究

Hantaan virus (HTNV) is the major pathogen responsible for causing severe hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in China. Its nucleocapsid protein (NP) is the most abundant viral protein, and play an important role in protect viral nucleic acid, assist virus replication, cellular transport of viral vRNP complexes, virions assemble, virus budding out of the cell and many other steps during virus life cycle. At present, immunogenicity of HTNV NP was study thoroughly, and the role of NP in virus replication also has great progress. Previously, we found a nuclear export signal (NES) and two nuclear localization signal (NLS) peptide on the NP by bioinformatics prediction. However, whether HTNV NP have nuclear-cytoplasmic shuttling function just like other virus capsid protein has not been reported. Based on this, current study will use molecular biology methods to determine whether NES or NLS has biological function and has it able to mediate NP nuclear-cytoplasmic shuttling. Furthermore, whether these signals regulate host interferon response? This study is going to reveals a new mechanism of HTNV NP in viral replication cycle, and provide a theoretical basis for the development drugs against HFRS.

在我国引起重型肾综合征出血热的病原体是汉滩病毒（HTNV），其核衣壳蛋白（NP）是病毒粒子中最丰富的蛋白，在保护病毒核酸、病毒复制、病毒vRNP复合物细胞转运、病毒粒子的组装和出胞等中发挥着重要的作用。目前对HTNV NP免疫原性的研究较为深入，对NP在病毒复制过程的作用也有一定进展。我们前期通过生物信息学预测发现HTNV NP上具有一段核输出信号（NES）和两段核定位信号（NLS）肽，而HTNV NP是否具有类似其他RNA病毒衣壳蛋白的核质穿梭功能则未见报道。在此基础上本研究拟通过分子生物学等方法来进一步确定我们预测发现NP的NES和NLS是否具有相应的生物学功能和是否能够介导NP的核质穿梭，并探讨这些信号是否调节宿主的IFN应答过程。本研究将揭示HTNV NP在病毒复制周期中新机制，并为HFRS相关药物提供理论基础。

临床表现为发热、出血和急性肾功能损害的肾综合征出血热（HFRS）是一种急性、烈性的传染病。我国是世界上 HFRS 疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，且没有特异性的治疗药物。在我国引起重型HFRS的病原体主要是汉坦病毒科、正汉坦病毒属的原型病毒——汉滩病毒（HTNV）。同其他汉坦病毒类似，HTNV是有包膜分节段的负链RNA病毒，其基因组分为L、M、S三个片段，分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn和Gc以及核衣壳蛋白NP。NP作为病毒生活周期中表达量最高的蛋白，在HTNV的生活周期中起到了具有十分重要的作用，课题组在前期研究中，通过NetNES分析发现HTNV NP上在102位氨基酸开始有一段信号极强的核输出信号（NES）。而利用PSORTⅡ算法和cNLS Mapper，我们分析发现了NP 172位氨基酸开始有一个的单分型的核定位信号（NLS），在388位氨基酸开始有一个双分型的NLS。前期国外也有研究组发现NP上单分型的的NLS具有阻断TNF-α介导的NF-кB入核的功能。近年来，多种RNA病毒的核衣壳蛋白被发现具有NES和NLS，并参与调节了宿主的IFN应答过程。本课题组利用分子生物学手段构建NP相应区段的荧光蛋白融合的截短体蛋白及相应关键氨基酸的突变体，明确了NP上的NES和NLS并不参与调控NP的核质穿梭，但是与内源性KPNA2有明显相互作用，与KPNA1有较弱的相互作用，并且利用亲和层析联合质谱等手段鉴定发现多种宿主蛋白与NP相互作用，通过筛选发现，正常情况下分布于细胞核的蛋白DDX17可在HTNV感染细胞时，在细胞浆中与HTNV NP共定位，并能调控HTNV的复制水平。同时DDX17也与KPNA2有明显相互作用。此外，为验证多种宿主蛋白在HTNV复制中的作用，本课题并建立了筛选评价方法，利用已知的功能蛋白评价体系的正确性并鉴定出新的宿主调控分子，此外还建立了药物的筛选评价方法，发表多篇SCI和中文核心文章。本课题为理清汉滩病毒复制机制提供了新的见解，也药物的研究提供了新的筛选方法和靶点，具有重要意义。