新型成骨诱导因子Nell-1ΔE的功能及其分子机制研究

Readily available and reliable bone graft material is essential for many orthopedic and craniofacial surgeries. The current gold standard for bone graft material is autologous bone. However associated donor site morbidity including pain, gait disturbance, thigh paresthesia for iliac crest donor sites, and infection, neurologic deficits, and hematomas for calvarial grafts make autograft harvest less than ideal. Thus, there is a critical need for better autograft alternatives. There are many translational studies on Nell-1's significant bone regeneration properties that complement our present work for this proposal. From a therapeutic standpoint, the osteoinductive properties of Nell-1 can be applied to situations where bone formation and regeneration are required (e.g., alveolar bone grafting, craniofacial distraction osteogenesis, spinal fusion, segmental long bone defects). Excitingly, our preliminary data suggests that Nell-1ΔE, which is a new transform of Nell-1, may be an even more potent osteoinductive agent than Nell-1 through the different signal pathways. this proposal addresses a practical need to further understand the function and mechanism of Nell-1 isoforms and fulfills our long term objective to identify, harness, and channel novel molecules that induces excess bone formation during craniofacial growth into reliable clinical therapies to regenerate bone.

很多正颌与颅面手术都需要易获取和可靠的骨移植材料。然而目前作为骨移植金标准的自体骨移植，在髂嵴取骨常伴发供区疼痛、步态异常等多种不良后果，且颅骨抑制物的感染损伤与血肿常使自体移植物达不到理想的成骨效果，因此亟需更好的方案改善其在骨组织修复临床的应用。利用成骨诱导分子促进骨组织损伤原位修复是解决骨自体移植问题的一个好方法。现有多篇Nell-1蛋白显著促进骨再生特性的研究被报道。Nell-1蛋白成骨诱导能力可以被用于骨形成和再生的多种状况（如牙槽骨移植，颅面骨牵张成骨和部分长骨缺损修复等）。我们最新克隆发现的Nell-1新型转录本Nell-1ΔE具有更显著的成骨诱导能力，并存在着区别于Nell-1蛋白诱导成骨的信号转导机制。继续深入研究Nell-1ΔE蛋白的功能，不断探索新的成骨诱导因子的功能机制将有助于发现更安全、有效的临床治疗方法，最终使新分子骨形成作用的潜力能应用到转化医学研究。

研究背景：很多正颌与颅面手术都需要易获取和可靠的骨移植材料。然而目前作为骨移植金标准的自体骨移植，在髂嵴取骨常伴发供区疼痛、步态异常等多种不良后果，因此亟需更好的方案改善其在骨组织修复临床的应用。不断探索新的成骨诱导因子的功能机制将有助于发现更安全、有效的临床治疗方法。..主要内容：探索Nell-1ΔE 基因在颅颌面骨发育中的生物学功能，进一步阐明Nell-1ΔE 诱导成骨的分子机制，将它在颅面生长过程中诱导骨形成的特性，应用到转化医学研究中，并最终促进其在骨损伤修复领域的临床应用。主要内容包括：.（1） Nell-1ΔE 特异性表达谱及其在促进成骨方面的作用。我们将检测Nell-1ΔE 在小鼠头部组织发育的时间特异性表达谱，以及在不同类型牙源性干细胞中进行免疫组化染色，以说明Nell-1ΔE 表达及其在促进成骨方面的作用。.（2） Nell-1ΔE 行使功能的分子机制。筛选并鉴定与Nell-1ΔE 相互作用的蛋白以揭示其诱导成骨的细胞信号转导通路。..重要结果：.（1） 根据Nell-1ΔE 特异性多肽表位制备其特异性抗体，采用免疫组化技术检测Nell-1ΔE 蛋白在小鼠头部组织不同发育时期的特异性表达谱；.（2） 将Nell-1ΔE 基因构建到带有flag-tag 的pcDNA3.1表达载体中，利用亲和层析的方法纯化Nell-1ΔE 蛋白。.（3）利用免疫共沉淀与质谱分析联用方法筛选与Nell-1ΔE 直接相互作用的蛋白。然后利用绿色荧光蛋白融合表达载体检测其在细胞内的共定位。..关键数据：.（1）免疫组化技术检测Nell-1ΔE 蛋白在小鼠头部组织不同发育时期的特异性表达谱；.（2）免疫组化技术检测Nell-1ΔE 蛋白在不同牙源性干细胞中的特异性表达谱；.（3）Nell-1及Nell-1ΔE蛋白的在哺乳动物细胞里的表达与纯化；.（4）Nell-1及Nell-1ΔE蛋白免疫共沉淀筛选出的相互作用蛋白韦恩图；.（5）Nell-1及Nell-1ΔE融合绿色荧光蛋白在细胞内的共定位。..科学意义：我们最新克隆发现的Nell-1 新型转录本Nell-1ΔE存在与Nell-1蛋白不同的表达谱，以及不同的相互作用蛋白与信号通路，预示其崭新的功能及临床应用前景。