基于SIRT1-自噬途径探讨益气活血方延缓血管内皮细胞衰老的分子机制研究

Endothelial cell senescence is the initial and pivotal link of vascular aging which may lead to cardiovascular disease. So the prevention of endothelial cell senescence is of great significance for prevention and treatment of cardiovascular disease. SIRT1-autophagy pathway activation is one of the hotspots in the research of aging, but it is lack of SIRT1-autophagy pathway based research on vascular aging. The research which is did by the applicant have found that yiqi huoxue fang can delay the aging of mice and the endothelial cells senescencein by inhibiting oxidative stress,and can be achieved through PPAR gamma and p53 pathway to delay vascular aging.Actually SIRT1 is closely associated with oxidative stress and it could regulate the cell life by PPAR gamma, p53.Thus we speculate that yiqi huoxue fang may delay vascular senescence by regulating SIRT1-autophagy pathway’s changing in the oxidative stress of endothelial cell.This study with replication senescence endothelial cell and hydrogen peroxide induced endothelial cell aging as the models, will observe the effects of yiqi huoxue fang on the regulation of mitochondrial ROS and its function and influence SIRT1-autophagy pathway by using techniques such as laser confocal and protein immunoblot technique, discuss the molecular mechanisms of endothelial cell senescence delayed by yiqi huoxue fang.Our study will reveal the scientific connotation of yiqi huoxue fang on removing stasis and promoting coronary circulation,and expand its application in the prevention and control of vascular aging.

血管衰老可能引起心血管疾病的发生，血管内皮细胞衰老是血管衰老的始发关键环节，因此，延缓内皮细胞衰老对于防治心血管疾病具有重要意义。SIRT1-自噬途径的活化是近年衰老研究的热点之一，但尚缺乏基于SIRT1-自噬途径与血管衰老的研究。前期研究发现，益气活血方通过抑制氧化应激延缓小鼠和内皮细胞的衰老，并可通过PPARγ与p53通路达到延缓血管衰老的作用。SIRT1与氧化应激关系密切，可通过PPARγ、p53调控细胞寿命，据此推测益气活血方可能通过调节细胞氧化应激下SIRT1-自噬途径的改变，进而延缓血管衰老。本研究以复制衰老内皮细胞与过氧化氢诱导内皮细胞衰老为模型，运用激光共聚焦、蛋白免疫印迹等技术，研究益气活血方对线粒体ROS及其功能的调节进而影响SIRT1与细胞自噬的变化，探讨益气活血方延缓内皮细胞衰老的分子机制。揭示益气活血方祛瘀生新、通脉活络的科学内涵，拓展其在血管衰老防治中的应用。

血管衰老可能引起心血管疾病的发生，血管内皮细胞衰老是血管衰老的始发关键环节，因此，延缓内皮细胞衰老对于防治心血管疾病具有重要意义。SIRT1-自噬途径的活化是近年衰老研究的热点之一，但尚缺乏基于SIRT1-自噬途径与血管衰老的研究。前期研究发现，益气活血方通过抑制氧化应激延缓小鼠和内皮细胞的衰老，并可通过PPARγ与p53通路达到延缓血管衰老的作用。SIRT1与氧化应激关系密切，可通过PPARγ、p53调控细胞寿命，据此推测益气活血方可能通过调节细胞氧化应激下SIRT1-自噬途径的改变，进而延缓血管衰老。本研究以复制衰老内皮细胞与过氧化氢诱导内皮细胞衰老为模型，运用激光共聚焦、蛋白免疫印迹等技术，研究益气活血方对线粒体ROS及其功能的调节进而影响SIRT1与细胞自噬的变化，探讨益气活血方延缓内皮细胞衰老的分子机制。 研究发现，益气活血方能够使两种造模状态下反映细胞衰老程度的SA-B-gal染色比例明显下降，并使细胞由停止分裂的G0-G1期减少进入分裂周期；在两种造模方式下，电镜下均观察到应用该方后氧化应激造成的自噬囊泡减少，对氧化应激造成的线粒体膜电位的下降有保护作用，能够明显提高线粒体内ROS清除酶MnSOD的活性，抑制荧光下ROS的生成，降低了自噬标记物LC3A/B的含量，使反映自噬流强弱的P62蛋白明显减低，并应用mRFP-GFP-LC3Ⅱ融合蛋白示踪发现自噬流下降，反映了该方可能有抑制H2O2和复制性衰老造成的氧化应激引起的细胞自噬的作用，从而延缓内皮细胞的衰老。应用中药后可使长寿蛋白SIRT1含量较模型组明显提高，对使用SIRT-1特异性阻滞剂EX527后,可使中药SIRT1含量仍旧高于模型组，但较前降低，说明中药有可能通过SIRT1通路起到延缓内皮衰老，降低自噬的作用，但因其作用不完全明确，还需要进一步做针对性研究才能确证。 该项目通过益气活血方对线粒体氧化应激状态下SIRT1-自噬通路的影响，进一步研究该方延缓血管衰老的细胞与分子机制，补充完善了益气活血方延缓血管衰老的相关机制，揭示益气活血方去瘀生新、通脉活络的科学内涵。