多重序列标签－生物发光序列解码法定量测定核酸序列差异和表达量差异的研究

在基因序列差异和基因表达量差异分析中，提高分析通量可以降低检测成本和提高检测效率，而常规方法是采用激发波长不同的荧光染料分别标记不同的待测靶标，但受荧光染料种类和可见光波长范围的限制，通常仅能同时分析2-4种靶标。本课题旨在采用序列标签结合生物发光序列解码技术建立一种可以在单管中同时检测10种以上不同的基因靶标。其基本原理是首先采用含有序列标签的探针与目的靶标杂交，如果完全互补就发生连接反应形成含有序列标签的连接产物；采用一对共用引物进行PCR扩增反应；再用焦测序技术定量测定标签序列，进行序列解码分析；最后根据测序结果对基因序列差异和基因表达量差异进行定量分析。本课题建立的方法无需荧光染料标记；对不同靶标的扩增无歧视性，定量性能好；测定仪器简单，不需要昂贵的基因序列测定仪；可以用于遗传学研究和疾病早期诊断。

在基因序列差异和基因表达量差异分析中，提高分析通量可以降低检测成本和提高检测效率，而常规方法是采用激发波长不同的荧光染料分别标记不同的待测靶标，但受荧光染料种类和可见光波长范围的限制，通常仅能同时分析2-4 种靶标。本课题采用序列标签结合生物发光序列解码技术，成功建立了一种可以在单管中同时检测12 种不同基因靶标的方法。该方法先人工设计一组含有来源特异性序列的标签，通过反转录反应或连接反应使目的靶标标记上序列标签；然后用一对共用引物进行PCR 反应，同时并行扩增多个被标记的产物；再用焦测序技术定量测定产物中的标签序列，进行序列解码分析；最后根据标签序列的定量分析结果来实现多个靶标的同时定量测定。. 本课题取得了如下创新性研究结果：（1）提出了基于序列条形码技术的无荧光标记多重核酸定量分析法；（2）建立了基于焦磷酸测序技术的高灵敏碱基序列解码法；（3）创建了基于核酸侵入反应和切刻反应的超高灵敏度核酸信号扩增法。. 本课题共发表论文18篇，其中SCI论文14篇，包括Angew Chem Int Ed （1篇）；Chem Commun（1篇）；Anal Chem （4篇）。申请专利6件，获得专利授权2件。. 本课题的科学意义在于建立了一种具有自主知识产权的多重核酸定量分析法，用于基因序列差异和基因表达量差异分析中，为遗传学研究和疾病早期诊断提供检测工具。