斑马鱼cd99l2基因对造血发育的调节作用及机制研究

CD99 antigen like 2 is a novel highly o-glycosylated cell adhension molecular, expressing on the membrane of vascular endothelial cells, white blood cells and lymphocyotes in hemopoietic and vascular system . Our preliminary data showed that cd99l2 was detected on red blood cells from 18 hours post fertilization(hpf) to 32 hpf , which is a critical developmental stage for zebrafish primitive erythropoiesis. Our data indicates that cd99l2 most probably regulates the development of erythrocyte and other blood cell lineages. Neverthless, research on those has not been reported yet. In this project, cd99l2 gene knock out zebrafish line will be established by transcription activator-like effector nucleases(TALENs), the phenotype changes of varial blood cell lineages will be observed in oder to analysis the the functions of cd99l2 in hematopoiesis ; meanwhile, cd99l2 gene will be overexpressed in red blood cells, by which the role of cd99l2 on the development of erythrocyte will be studied. This research will clarify the fuctions of cd99l2 in hematopoiesis，deepen the understading of molecular regulation network of hematopoietic cell development, as well as the mechanisms of hematological-related diseases, which will provide new theoretical bases for the diagnosis and treatment of hematological-related diseases.

CD99 antigen-like 2（cd99l2）是一种高度糖基化的细胞粘附分子，造血和血管系统表达在血管内皮细胞、白细胞和淋巴细胞的细胞膜上。我们前期研究发现：斑马鱼cd99l2基因在受精后18-32小时可在红细胞膜上检测到，这是原始造血过程中红细胞发育的关键时期。此研究结果提示：cd99l2极有可能调节红细胞及其它谱系的血细胞发育，但相关研究未见报道。本项目利用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术建立斑马鱼cd99l2基因突变品系，观察各个血细胞谱系细胞发育的表型变化，分析cd99l2基因在造血发育过程中的功能；同时，特异性在红细胞过表达cd99l2基因，研究其对红细胞发育的影响。本研究可阐明cd99l2对造血发育的影响，能加深对造血细胞发育调控的分子网络及血液系统相关疾病发病机制的认识，将为血液系统相关疾病的诊断和治疗提供新的理论基础。

CD99-like 2 (CD99L2)是I型跨膜糖蛋白,作为CD99的旁系同源基因被发现，两者有32%的序列一致性。CD99L2目前已知的主要功能是参与细胞聚集和白细胞外渗。前期研究我们利用TALEN技术建立斑马鱼cd99l2基因缺陷突变体模型，总共筛选到15种新的突变基因型。挑选其中cd99l2SMU13和cd99l2SMU40两种基因突变体，利用qPCR技术分别检测两种突变体的血液（红系、髓系、淋巴系和造血干细胞）各个谱系标记物的表达变化情况。结果显示：两种基因突变体的各个造血谱系的标记物的表达量与野生型相比无明显差别。待cd99l2SMU13和cd99l2SMU40两种基因突变体发育至成鱼，分别取外周血和肾脏观察血细胞各个谱系的细胞形态，结果提示：与野生型相比无显著差异。除此之外，利用qPCR技术检测过表达cd99l2基因各个血细胞发育状况，结果显示：与野生型相比无显著差异。因此，cd99l2基因敲除和过表达均对各个谱系血细胞的发育无影响。利用MO技术敲低斑马鱼cd99l2基因观察检测血液（红系、髓系、淋巴系和造血干细胞）各个谱系的标记物的表达变化情况，结果显示阻断翻译起始位点的MO，导致胚胎血液循环被阻滞，注射cd99l2 mRNA表型可以被拯救。结果提示： cd99l2基因表达降低可能影响其他细胞表面粘附分子高表达导致血液循环阻滞。此外，利用tg（coroni1a：eGFP） （lyc ：dsred）转基因斑马鱼观察cd99l2基因突变体中，中性粒细胞免疫应答能力。结果显示：cd99l2基因突变体中中性粒细胞向切口的迁移能力与野生型相比无差别 。综上所述，cd99l2基因敲除与敲低实验结果不一致，推测可能是由于机体内存在与cd99l2基因相似功能的基因发挥了作用，即cd99l2的旁系同源基因cd99。而且尚未发现cd99l2基因缺陷与中性粒细胞免疫功能有关。