利用转基因斑马鱼研究LaminA/C对造血发育的影响及分子机制的研究

The LMNA gene produces A-type lamins, which provides a scaffold for the organization of nuclear to support the normal form of the nuclear envelope, and has been implicated in the maintenance of nuclear architecture and chromatin structure. Despite many studies demonstrating the mutations of laminA/C are associated with a variety of malignant hematologic diseases, affected skeletal muscle, cardiac muscle and fat to nurve and so on.And some changes in the expression of LMNA are observed in the malignant hematologic diseases,but its hematopoiesis developmental role as well as the molecular mechanisms involved are still poorly understood.Zebrafish are being increasingly used as a model organism to study .Hematopoiesis. This genetically tractable model has many appealing features, such as zebrafish eggs are fertilized externally and are transparent to readily available for observation the whole progress of the hematopoiesis. We suggest to use antisense morpholino oligo to knockdown laminA/C expression in the generated transgenic zebrafish lines with fluorescent protein-tagged Hematopoietic transcription factor,tracing the cell, assessed the blood cell circulation throughout development, investigate the LaminA/C function in the hematopoiesis. and its the molecular mechanisms involved . It will give help for generating new zebrafish models for understanding the LaminA/C gene, and enhance to demonstrate the functions of the gene in laminopathies progress.

核纤层蛋白是维持核膜正常形态的主要骨架蛋白，在提供染色体锚定位点以及在核周期性的解体和重组装过程中发挥着重要作用。其中核纤层蛋白LMNA（laminA/C）异常可以引起骨骼肌、心肌、脂肪和神经等各个组织的严重或恶性病变，也可以引起血液系统的恶性疾病。但是其对造血发育影响的研究，以及发病机制及分子机制的研究罕见报道。因此，本课题利用斑马鱼独特生物学和遗传学优势，即造血调控网络与人类高度保守、胚胎体外发育而且通体透明、可直接动态监测造血发育全过程，便于进行细胞生物学研究等特点，遂利用可示踪的各造血祖细胞转基因斑马鱼模型，在斑马鱼体内分别下调laminA/C基因；进一步探讨laminA/C在造血发育过程中的功能，阐明其可能的机制，以期深入对核纤层蛋白laminA/C的认识，并为人类疾病斑马鱼模型的构建和研究提供参考。

核纤层蛋白是维持核膜正常形态的主要骨架蛋白，在提供染色体锚定位点以及在核周期性的解体和重组装过程中发挥着重要作用。其中核纤层蛋白LMNA（laminA/C）异常可以引起骨骼肌、心肌、脂肪和神经等各个组织的严重或恶性病变，也可以引起血液系统的恶性疾病。但是其对造血发育影响的研究，以及发病机制及分子机制的研究罕见报道。本课题利用斑马鱼独特生物学和遗传学优势，即造血调控网络与人类高度保守、胚胎体外发育而且通体透明、可直接动态监测造血发育全过程，便于进行细胞生物学研究等特点，利用可示踪的各造血祖细胞转基因斑马鱼模型，在斑马鱼体内分别下调laminA/C基因；探讨了laminA/C在造血发育过程中的功能，阐明了其可能的机制，深入了对核纤层蛋白laminA/C的认识，并为人类疾病斑马鱼模型的构建和研究提供重要的参考。首先,生物信息分析结果提示斑马鱼的lmna、lmnb1和lmnb2基因是人类lmna、lmnb1和lmnb2基因的直向同源物。本研究发现斑马鱼体内LMNA基因表达两种蛋白质。采用morpholino技术可显著降低斑马鱼体内LMNA基因的表达量。LMNA基因下调后斑马鱼体内原始造血、定向造血期造血干细胞以及红系造血和髓系造血相关的转录调控因子的表达明显下降，尤其对淋系造血影响明显, 提示LMNA基因下调对胚胎期造血有明显的负调控作用。同时,利用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼lmna基因进行编辑，构建了lmna基因的4个突变体靶序列重组质粒，筛选到第8号外显子区4#靶点为最佳靶点，获得了lmna基因敲除的斑马鱼早老疾病模型，为深入研究lmna基因的功能和人核纤层病奠定了重要的基础。在国内外首次建立了斑马鱼体内下调laminA/C的研究模型，为开展LMNA的分子机制研究和新药研发提供理想的动物模型. 通过下调laminA/C基因，了解laminA/C在造血系统中的功能，促进了对laminA/C功能的深入认识，为进一步研究核纤层蛋白病提供重要的研究基础，为治疗提供新的思路和途径，继而利于寻找针对的靶向方法和药物，具有重要的科学价值和巨大的应用前景。