肺泡表面活性物质相关蛋白SPB和SPC的异常表达与克隆牛肺脏塌陷的关系

Alveolar collapse is a key cause of death of newborn cloned cattle and low efficiency of cloning. Pulmonary surfactant associated proteins, SPB and SPC, have a crucial role in maintaining regular alveolar volume. However, the regulatory mechanisms of SPB and SPC abnormal expression in collapsed lung of neonatal dead cloned cattle are rarely studied. On the basis of our studies on pathologic diagnosis, cDNA array data of collapsed and normal lung and verified differential expression of SPB and SPC, here we will try to elucidate the promoter DNA methylation, histone modifications and TTF-1 binding differences of SPB and SPC genes between collapsed lung of neonatal dead cloned cattle and healthy lung of age-matched normal cattle by bisulfite-sequencing and CHIP, predict and validate microRNAs that may regulate expression of SPB and SPC, study the influence of protein phorsphorylation of EGFR pathway on expression of SPB and SPC by phorsphorylation chip. So, regulation of SPB and SPC genes expression in collapse lung will be analyzed at mutil angles and mutil levels. We will contribute significantly to the elucidation of the mechanism of alveolar collapse of neonatal cloned cattle and the improvement of the efficiency of animal cloning by implementation of this program.

肺脏塌陷是导致新生克隆牛死亡、克隆效率降低的重要原因之一，肺泡表面活性蛋白SPB和SPC是维持肺泡容积稳定的重要蛋白，但新生克隆牛塌陷肺脏中SPB和SPC异常表达的调控机制还未见报道。在病理检查，比较cDNA表达谱，验证SPB和SPC基因异常表达的基础上：本研究将采用亚硫酸盐测序、染色质免疫共沉淀（ChIP）等技术研究新生死亡克隆牛塌陷肺脏中SPB和SPC基因启动子DNA甲基化、组蛋白修饰以及基因启动子区转录因子TTF-1的结合丰度；利用生物信息学技术及细胞转染技术预测并验证可能影响SPB和SPC蛋白生成的microRNA；采用蛋白质磷酸化芯片技术，研究EGFR信号通路磷酸化修饰对SPB和SPC基因表达的影响。从多角度、多层次研究塌陷肺脏中SPB和SPC基因异常表达的调控机制。本项目的实施，将为新生克隆牛肺塌陷分子机制的阐明和克隆牛生产效率的提高奠定重要的理论基础。

肺脏塌陷是导致新生克隆牛死亡、克隆效率低下的重要原因之一。肺泡表面活性物质相关蛋白SPB和SPC是维持肺泡容积稳定的重要蛋白。前期研究显示新生克隆牛塌陷肺脏中肺泡表面活性物质相关蛋白SFTPB和SFTPC基因的mRNA及蛋白质表达水平均显著低于正常肺脏。本项目对新生克隆牛塌陷肺脏中SFTPB和SFTPC基因异常表达的调控机制开展了系统的研究。研究发现，塌陷肺脏中SFTPB和SFTPC基因启动子区的DNA甲基化未出现上调，塌陷肺脏和正常肺脏中SFTPB和SFTPC基因启动子区组蛋白修饰（H3K9me3、H3K4me3、H3K9ac）差异均不显著（P>0.05），而SFTPB和SFTPC基因启动子区转录因子TTF-1的结合丰度分别为正常肺脏中的24.5%和28.0%，显著少于正常肺脏（P<0.05），由此揭示，转录因子TTF-1结合量低是塌陷肺脏中SPB和SPC基因转录水平下降的原因。同时，我们对塌陷肺脏和正常肺脏的miRNAs进行测序，获得了177个差异表达的miRNAs，并利用生物信息学技术预测到6个靶向于 SFTPB、SFTPC和TTF-1基因的miRNA，荧光素酶结果显示其中3个miRNAs靶向于SFTPC和TTF-1基因，但是由于这些miRNAs在塌陷肺脏中变化幅度较小（1.2<FC<1.5），推测其调节蛋白生成的作用不显著。此外，本研究利用磷酸化蛋白质组iTRAQ定量分析技术，筛选获得了塌陷肺脏与正常肺脏中的差异磷酸化蛋白质25个，其中EGFR通路差异磷酸化蛋白质4个，这四个差异磷酸化蛋白对SFTPB、SFTPC基因的调控作用有待于进一步的实验验证。综合以上结果，本项目初步阐明了新生克隆牛肺脏塌陷及SFTPB和SFTPC基因表达下调的分子机理，为防治克隆动物的肺脏塌陷提供了重要的理论依据，为克隆程序的改善提供了重要的启示性线索。项目资助发表SCI论文1篇，核心期刊论文2篇，授权国家发明专利1项，在审实用新型专利3项，另有1篇SCI论文在审稿中。本项目培养本科生2名，其中1名已毕业。项目投入经费24万元，支出22.4340万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费1.5660万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。