卵泡抑素样蛋白1在肾癌中低表达促进转移的表观调控机制

In the previous study, by using microarray screening combined with a cohort study to validate, we confirmed the low expression of follistatin-like protein 1 (FSTL1) in renal cell carcinoma (RCC). Functional studies have shown that FSTL1 gene inactivation may play a pivotal role in renal carcinogenesis. Thus, restoring the FSTL1 gene expression might be important in the targeted therapy for RCC patents. The key point in this study is to clarify the molecular mechanism of FSTL1 gene silencing through epigenetic modification, thus releasing the brake of cancer signaling pathways to promote cancer metastasis. In the present study, we plan to ①verify the role of promoter hypermethylation in FSTL1 gene silence process in the study of RCC clinical samples and cell lines, ② screen the FSTL1 silencing related methylation binding protein (MBD) by ChIP assay, inhibit the MBD expression via shRNA-MBD strategy and explore the re-activation of FSTL1 expression, clarify the effect of restoration of FSTL1 expression on RCC metastasis in nude mouse model, ③ identify and validate the role of FSTL1 regulated downstream signal pathways in the invasion and metastasis of RCC by transcriptional sequencing and the cohort study, respectively. It is helpful to elucidate the mechanism of FSTL1 epigenetic regulation in the development of RCC and provides theoretical foundation for the target therapy of metastatic RCC.

我们前期应用芯片筛查结合队列研究证实卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在肾癌中低表达。功能研究发现该基因失活在肾癌的恶性进展中起重要促进作用。因此，恢复FSTL1表达可能在肾癌靶向治疗中有重要意义。本课题的关键科学问题是阐明FSTL1基因通过甲基化修饰被沉默, 从而解禁下游促癌信号通路促进癌症转移的分子机制。本课题拟①通过对肾癌临床样本及细胞系的研究, 确证启动子高甲基化在沉默FSTL1基因表达中的作用；②采用ChIP技术筛选与FSTL1沉默相关的甲基化结合蛋白(MBD)，并以shRNA-MBD策略抑制MBD表达，探索其在逆转FSTL1沉默中的作用，用裸鼠模型验证逆转FSTL1沉默对肾癌转移的影响；③应用转录组测序发现并在队列研究中探讨受FSTL1调控的主要信号通路在肾癌侵袭和转移中的作用。本课题有助于阐明FSTL1表观调控在肾癌发生发展中的作用机制, 为转移性肾癌靶向治疗奠定理论基础。

基因FSTL1的失活可能在RCC的恶性进展中起到重要促进作用，推测恢复FSTL1表达可能在RCC靶向治疗中有重要意义。本研究的主要研究内容及结果如下：（1）确证启动子高甲基化在沉默FSTL1基因表达中的作用，FSTL1表达与基因甲基化程度显著负相关，筛选发现8个CpG位点甲基化水平与FSTL1表达水平显著负相关，其中4个CpG位点位于FSTL1基因启动子区域，且肿瘤分期越高，该4个CpG位点甲基化水平越高。 cg00091633、cg20114394、cg13408152位点高甲基化者预后更差；经5-Aza-CdR抑制 RCC细胞甲基化后，细胞表面干性标志物表达水平降低，细胞表面PD-L1表达水平降低，FSTL1表达上升，RCC细胞恶性程度降低，甲基化修饰在沉默FSTL1基因表达及肾癌肿瘤细胞恶性进展中发挥作用。（2）明确FSTL1基因相关的甲基化结合蛋白，发现甲基化结合蛋白A与蛋白B都可与FSTL1基因启动子区甲基化岛结合，然而蛋白A是介导FSTL1基因甲基化沉默的重要蛋白；肾癌组织中的A蛋白低表达，肿瘤分期与A蛋白水平表达负相关，癌中A低表达者预后较差。甲基化结合蛋白A可能通过介导肿瘤免疫微环境在肾癌恶性进展中发挥抑癌作用；甲基化结合蛋白B转录水平高的肾癌患者预后更好。然而，体外实验结果表明肾癌细胞系沉默B蛋白后，细胞恶性程度降低。（3） FSTL1可能参与T细胞受体信号通路，JAK/STAT 信号通路，细胞连接, 细胞因子相互作用，趋化因子信号途径，免疫细胞功能，进而影响肿瘤细胞的表型及功能。FSTL1可能通过抑制NF-κB通路活性发挥抑癌作用。此外，沉默FSTL1基因后PI3K通路活性减弱。FSTL1与HIF1α和HIF2α在转录水平上呈正相关，FSTL1高表达者预后更差，HIF2α高表达者预后更差。以上发现为寻找肾癌特异的治疗靶点，提高治疗效果、预测肾癌患者不良预后提供了科学依据。本项目共发表SCI论文1篇，中文核心期刊1篇；申请中国发明专利1项；培养硕士研究生2名。