可逆型长寿细胞构建及用于绵羊体细胞基因打靶的研究

以体细胞克隆为基础的家畜基因打靶技术目前存在的最大技术瓶颈是体细胞寿命有限，打靶细胞难以分离、扩增和鉴定。研究证实，表达人端粒酶催化亚基基因（hTERT）可以诱导细胞永生化，但永生化细胞不能用于体细胞克隆。因此，必须构建出细胞寿命可逆的细胞才能用于生产基因打靶动物。为了解决这个问题，本项目在申请人前期研究基础上，提出建立Cre/loxP系统介导的hTERT可逆表达和细胞寿命可逆调节体系，把该体系用于体细胞基因打靶。项目设计以绵羊细胞为研究材料，拟构建可逆型长寿细胞技术体系，并通过myostatin基因打靶来验证该体系的效率。本项目的实施有望解决体细胞基因打靶技术的瓶颈问题，对改进家畜基因打靶技术，推动基因打靶技术的发展有重要意义。

在体细胞中进行基因打靶并通过克隆技术生产出动物，目前仍然是实现家畜遗传修饰的主要技术途径，但体细胞增殖能力弱造成这一技术体系的效率极低。本项目旨在通过条件性表达外源人端粒酶基因（hTERT）来可逆延长体细胞寿命，以提高体细胞基因修饰的技术效率。通过本项目的实施，我们已完成项目全部研究内容，实现了预期目标。所取得的主要研究结果如下：1. 建立了Cre/loxP系统介导的条件性表达hTERT基因的方法，并在绵羊胎儿成纤维细胞中验证了这一系统的效果；2. 建立了Tet-on系统介导的可诱导表达hTERT基因的方法，并在绵羊胎儿成纤维细胞和成年羊皮肤成纤维细胞中验证了这一系统的效果；3.在hTERT诱导长寿的细胞中进行转基因实验，结果表明诱导长寿细胞转染外源基因（myoD）后单克隆细胞存活率达到78.5%，显著高于非长寿细胞（51.6%）；4. 探索了锌指核酸酶（ZFN）敲除绵羊肌肉抑制素myostatin基因的技术，并建立了Tet-on系统介导的条件性表达ZFN的方法，得到了myostatin基因突变的绵羊胎儿成纤维细胞系；5. 建立了CRISPR/Cas9基因打靶方法，得到了基因打靶的小鼠；6. 在诱导长寿的绵羊成年体细胞中利用CRISPR/Cas9技术进行了基因打靶，证实打靶后单细胞克隆存活率达到57.8%。上述结果表明，本项目建立的条件性表达hTERT的方法可以显著延长绵羊原代细胞的寿命，实现对细胞寿命的可逆调节，并提高细胞转基因和基因打靶的效率。本项目研究结果对改良动物遗传修饰技术体系有重要意义。