5羟甲基胞嘧啶及Tet蛋白在早期胚胎DNA去甲基化过程中的作用机制研究

5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是最近发现的一种新的DNA修饰，它是在Tet蛋白作用下由5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）转化而来，但目前对这一修饰在动物基因组中的分布和生物学功能仍知之甚少。根据申请人前期的实验观察，5hmC可能参与哺乳动物受精卵的DNA主动去甲基化过程，为验证这一假说,本申请项目拟对小鼠、绵羊受精胚胎和克隆胚胎中的5hmC水平、5hmC与5mC之间关系以及Tet蛋白在调节这一过程中的作用进行深入研究。本课题的实施对我们了解5hmC和Tet蛋白的生物学功能、揭示DNA主动去甲基化的机制，有重要意义。

5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是近年发现的一种新的DNA修饰，它是在Tet蛋白作用下由5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）转化而来，本项目旨在阐明Tet蛋白在介导哺乳动物胚胎中5hmC形成以及诱发DNA主动去甲基化过程中的作用。本项目基本按照原研究计划执行，并在完成原研究计划的基础上又扩展了研究内容。主要完成内容及结果如下：1）在两种动物(小鼠和绵羊)受精卵上完成了5hmC和5mC检测并分析了二者之间的相关性。小鼠受精卵原核期发育过程中父本DNA发生了5mC到5hmC的转换；绵羊受精卵也存在类似过程，尽管和小鼠有所差异。因此表明，5mC到5hmC的转换是哺乳动物受精卵中父本DNA主动去甲基化的普遍机制。2）在绵羊克隆胚胎中分析了5hmC和5mC之间的相关性。结果表明体细胞核被移植到卵母细胞中后，体细胞DNA也发生了一定程度的5mC到5hmC的转换，说明卵母细胞具有调控外来基因组产生5hmC的能力并由此介导DNA去甲基化过程。3）在小鼠受精卵中研究了Tet蛋白家族成员的作用。利用RNA干涉下调Tet家族基因表达后，受精卵发育能力和下游相关基因都发生了改变，说明Tet蛋白在早期胚胎发生过程中发挥着重要作用。此外，还证实Tet蛋白对2细胞胚胎中的主动去甲基化也有一定作用。4）研究了体细胞中过表达Tet家族基因对5hmC及5mC动态变化的影响及相关机制。结果发现Tet3和Tet1作用有所不同，虽然Tet3可以诱发5hmC的生成，但不能导致5mC的减少。进一步研究发现，Tet3和DNMT家族蛋白以及Stella蛋白之间有相互作用。5）研究了Tet蛋白在调控肌肉细胞分化过程中的作用。发现成肌细胞C2C12分化为肌管后5hmC水平升高，同时Tet1和Tet2表达也上调。通过RNAi实验进一步证明，Tet2对肌肉分化相关基因表达和C2C12分化是必需的。维生素C促进5hmC的生成和肌肉细胞的分化也是通过Tet2途径。6）研究了化学分子对体细胞表观遗传修饰的调控作用。利用维生素C和chaetocin等化学物处理绵羊成纤维细胞，证明它们可以分别调控DNA甲基化和组蛋白H3K9甲基化，这些化学物处理可能有利于提高克隆胚胎发育能力。上述研究结果对了解DNA去甲基化发生机制及其在调控胚胎发育和细胞功能中的作用有重要科学意义。