DsRed2基因作为体细胞基因打靶负筛选因子的研究

利用体细胞基因打靶技术制备转基因动物的最大障碍是：体细胞易于衰老、同源重组效率低而随机整合效率却异常高。本课题前期研究结果首次初步表明：DsRed2基因作为基因打靶负筛选因子不仅能够有效地富集中靶克隆，而且，与HSV-tk相比，DsRed2作为负筛选因子，在正负筛选过程中，不需在培养液中添加GANC，避免了GANC对富集的克隆细胞的毒性作用，从而有利于中靶细胞的扩大培养；但以中靶细胞作为核供体，是否能够获得基因打靶克隆牛还有待于进一步研究。本课题拟将用已构建的打靶载体pNRTCNbG转染牛胎儿成纤维细胞，以DsRed2作为负筛选因子，富集中靶克隆；用中靶细胞作为核供体，通过核移植获得基因打靶克隆牛。本研究如取得成功，将充分证明DsRed2基因可以作为体细胞基因打靶负筛选因子，首次建立一种以DsRed2基因作为负筛选因子采用正负筛选策略对乳蛋白基因座进行打靶制备动物乳腺生物反应器的技术路线。

体细胞基因打靶由于体细胞有限的生命期和体细胞基因打靶同源重组效率要比干细胞低两个数量级使得体细胞基因打靶异常困难。这暗示了我们需要建立有效的体细胞基因打靶策略。为了研究DsRed2基因在体细胞基因打靶正负筛选策略中作为负筛选因子的作用，在本课题前期研究中，我们构建了以neo基因作为正筛选因子、以DsRed2基因及HSV-tk基因作为负筛选因子、重组人GDNF cDNA基因敲入牛beta-casein基因座的正负筛选打靶载体；在本研究中我们采用组织块贴壁法分离培养了雌性牛胎儿成纤维细胞，用线性化打靶载体电击转染了4.0×107个牛胎儿成纤维细胞。转染细胞分为两等份，一份用G418和GANC抗性筛选8-10天后，在荧光显微镜下排除红荧光细胞克隆，用克隆杯法分离扩培非红荧光细胞克隆，PCR及PCR产物测序法鉴定1个克隆为中靶克隆，但该克隆细胞在扩培过程中衰老死亡，不能用于核移植。另一份转染细胞除了在抗性筛选上仅用G418外，其它程序与第一份细胞完全相同，结果获得了3个中靶克隆。DsRed2基因和HSV-tk基因的富集效率分别为4倍和2倍。以中靶细胞为核供体，去核牛卵母细胞为胞质受体制作基因打靶克隆胚胎，获得了23枚囊胚，将23枚囊胚移入8头代孕母牛，3个月后代孕母牛全部返情。我们的研究结果表明：DsRed2基因能够作为负筛选因子，富集重组人GDNF cDNA基因敲入牛beta-casein基因座的中靶克隆；DsRed2基因代替HSV-tk基因作为负筛选因子能够避免G418对中靶克隆细胞的毒害作用，有利于中靶克隆细胞的扩大培养；同时，也可以通过基因打靶载体随机整合而表达红荧光蛋白的细胞数量来判断打靶载体转染细胞的效率，有利于转染条件的优化。. 此外，本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺特异表达载体pNR-GDNF，用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中，经RT-PCR和Western Blot检测表明该表达载体具有生物活性。然后将该表达载体电穿孔转入牛胎儿成纤维细胞，用G418筛选7天后，将形态正常、生长旺盛的抗性细胞分离、扩培，PCR法鉴定转基因细胞；以转基因细胞为核供体，去核牛卵母细胞为胞质受体制作转基因克隆胚胎，获得了37枚囊胚。该研究为制备随机整合的重组人GDNF牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。