活血化瘀中药（丹参）对平滑肌BKCa的激活与通道Ca2+功能域和电压感受器的相关性研究

血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）是血管张力的主要调控器，受Ca2+和膜电位的调节。前期工作证实丹参的主要活性药物丹参酮IIA磺酸钠（DS-201）的舒血管作用与其激活BKCa有关，本项目提出假说DS-201的作用靶点是通道胞浆结构域（CTD）的Ca2+亲和位点和/或电压感受器（VSD）功能域。因此本研究联合应用电生理和分子生物学技术，以BKCa及其突变体通道为对象，研究DS-201引起的通道电生理特性的改变。通过突变CTD中氨基酸D895和D897，在Ca2+ bowl功能突变体证实DS-201与Ca2+的相关性；通过分别突变VSD中的12个带电荷氨基酸，在电压感受器功能突变体证实DS-201与电压感受器的相关性，从而寻找到药物作用靶点并阐明药物作用机制。该研究在药物的合理应用和药效物质筛选的应用上有重要意义和实用价值，将促使建立的分子电生理技术成为中药药效评价及研究的重要手段。

血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）是血管张力的主要调控器，受Ca2+和膜电位的调节。基础工作研究丹参酮IIA磺酸钠（DS-201）的舒血管作用及其激活BKCa关系。本研究进一步联合应用电生理和分子生物学技术，以BKCa及其突变体通道为对象，在Ca2+ bowl功能突变体证实DS-201与Ca2+的相关性，在电压感受器功能突变体证实DS-201与电压感受器的相关性，力图寻找到药物作用靶点并阐明药物作用机制。.项目首先完成了丹参酮IIA磺酸钠（DS-201）在人体和动物的天然平滑肌细胞上的基础研究，为药物靶点的探明做好铺垫。项目利用多种膜片钳技术，以人体动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）突变体为研究对象，在表达细胞上研究DS-201的作用及作用机制，特别是利用通道突变体，研究突变体对DS-201引起的通道电生理特性改变的影响。具体执行情况：.1. 完成了丹参酮II磺酸钠对人体动脉平滑肌细胞和猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）作用的研究，为在转染BKCa通道的细胞上进行丹参酮IIA磺酸钠的作用靶点的确定奠定下基础。1）IP3通过激活猪冠状动脉平滑肌上BKCa降低血管张力的研究；2）钩藤碱对猪冠状动脉平滑肌舒缩作用的影响及其机制；3）人体高血压时血管平滑肌细胞膜BKCa功能异常机制研究。研究结果用于成果“大电导钙激活钾通道在血管舒缩调控中的功能作用及其临床意义”鉴定和请奖，获得泸州市科技进步特等奖和四川省科技进步二等奖。.2. BKCa通道及其重建体上的DS-201作用研究。完成了BKCa通道的稳定表达的HEK293细胞系的构建；对比研究了DS-201在天然细胞和表达细胞上BKCa作用的差异；开展了在BKCa表达细胞上进行药物作用研究；开展了BKca重建到脂质及人工BKCa构建膜实验；开展了丹参酮IIA磺酸钠（DS-201）脂质体的制备及其对BKCa激活作用的研究；开展了BKCa通道在非洲爪蟾卵母细胞上的表达及其电流记录研究。.3. BKCa通道及其突变体的构建及研究： 1）Ca2+高敏感位点突变实验结果显示，这些Ca2+敏感位点的突变，都不影响DS-201对BKCa的激活，表明DS-201激活BKCa的结合位点不是Ca2+结合位点。2）进一步的实验在已经构建的12个电压感受器通道上测试DS-201的作用，还将测试DS-201对通道开关的影响