睾丸细胞外泌体miRNAs调控精原干细胞分化的作用及机制研究

The differentiation of the spermatogonial stem cell (SSC) is the critical step for male reproduction. The process of differentiation is regulated by the microenvironment of the testis. However, the mechanisms by which microenvironment factors commit to SSC differentiation are still unclear. Exosome-miRNAs take part in the regulation of various biological processes such as cell differentiation, proliferation, and apoptosis. It is an important component of microenvironment. The project preliminary studies shows that exosome derived testicle cells promoting the differentiation of SSC. And miRNA microarray data suggested that exosome miRNA may played an important role in the differentiation of SSC. In this study, we will systematically study role of the exosomes miRNA in the differentiation of SSC by using the approaches for molecular biology and cell biology and high-throughput sequencing. Thourgh our study, we are expecting to disclose the mechanism of exosome miRNAs in SSC differentiation, which would provide novel mechanisms underlying spermatogenesis and are of great significance in treating male infertility and preventing defect of offspring.

精原干细胞（SSC）分化是决定雄性生殖的关键，其分化过程受睾丸微环境的精细调控。但微环境中调节因子的组成及其对SSC分化的作用及机制远未彻底阐明。外泌体携带的miRNAs广泛参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程，是细胞微环境的重要组成。前期研究表明，睾丸体细胞来源外泌体对SSC的分化具有促进作用，同时miRNA芯片结果提示miRNA可能是外泌体参与调控SSC分化的关键因素。基于上述科学问题，项目拟运用高通量测序、细胞生物学和分子生物学等方法系统地研究睾丸微环境中的外泌体对SSC的分化调控作用，明确其中起作用的关键miRNAs及其作用靶点，阐明外泌体miRNAs调控SSC分化的分子机制。为SSC发育和分化提供新的调控理论基础，为男性不育症的诊治提供新靶点，对揭示精子发生的分子机理、降低不孕不育率、预防子代遗传缺陷等都有重大意义。

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是雄性哺乳动物个体中唯一能够将遗传信息以自然交配的方式传递给子代的成体干细胞。SSCs的分化是决定雄性生殖系统平衡和健康的关键，其分化过程受睾丸支持细胞、间质细胞、睾丸微环境的精细调控。但微环境中调节因子的组成及其对SSCs分化的作用及机制远未彻底阐明。外泌体携带的非编码小RNA（miRNAs）广泛参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程，是微环境的重要组成。目前，有关睾丸支持细胞及间质细胞外泌体对SSCs的调控作用，尚未有研究报道。本研究以睾丸支持细胞、间质细胞所分泌的外泌体对SSCs分化调控作用为切入点，研究睾丸细胞外泌体及其中的miRNAs调控SSCs分化的分子机制。.本项目首先分离睾丸支持细胞和间质细胞的外泌体，并从颗粒直径、结构特征、标记蛋白三个方面进行鉴定。然后，探究两种外泌体对SSCs分化的影响，并进行外泌体miRNA测序，筛选差异miRNA，对差异miRNA的靶点进行预测。最后，在SSCs中过表达或“敲低”该miRNA，通过Real-time PCR、Western Blot、免疫荧光等技术检测过表达或敲低该miRNA后SSCs中分化相关基因/蛋白表达水平的变化。结果我们成功的从睾丸支持细胞和间质细胞中分离出外泌体，其鉴定结果符合外泌体的典型特征。明确了睾丸支持细胞所分泌的外泌体较睾丸间质细胞外泌体对于启动SSCs减数分裂有显著的促进作用，并由测序结果筛选出miR-486-5p在睾丸支持细胞的高表达，该miRNA通过与PTEN的3’UTR结合抑制PTEN的表达，激活AKT信号通路，上调STRA8的表达，进而启动SSCs的减数分裂。.上述结果表明在睾丸支持细胞和间质细胞外泌体中对SSCs分化起调节作用的主要为支持细胞的外泌体；支持细胞外泌体中的miR-486-5p通过靶向PTEN，激活AKT信号通路，上调SSCs减数分裂关键蛋白STRA8表达，启动SSCs的减数分裂，调控SSCs分化。.