Orai1 与BKca钾通道耦联及其对血管平滑肌张力影响的研究

钙释放激活钙通道（CRAC）为典型钙库释放而激活的钙通道（SOC），Orai1是通道孔道形成单位。文献报道TRPC形成的SOC通过激活大电导钙激活钾通道（BKca）而调节血管平滑肌的收缩。近年我们发现Orai1与非选择性阳离子通道TRPC结合协同构成SOC。为探索Orai1是否参与此调节过程，我们的预实验发现Orai1亦与BKcaα亚基直接结合，结合位点为Orai1的N端与BKca的RCK1结构域。本课题拟在证实Orai-BKca直接结合的基础上,采用原代培养的VSMC为实验模型，使用CRAC通道的特异性抗体、OraiG98A负显性突变慢病毒及其特异性阻断剂，结合分子/细胞生物学及电生理技术，从分子、细胞、组织不同层面解析CRAC与BKca结合对VSMC超极化的影响，探讨CRAC-BKca耦联在调节平滑肌缩张性中的作用机制。

通过分子和细胞生物学手段，证实了BKCa与Orai1之间存在物理性结合，BKCa的RCK1结构域的350-383氨基酸残基和RCK2结构域的721-813氨基酸残基可与Orai1蛋白结合；Orai1的N端与C端与BKCa蛋白均有结合，但N端结合更强，其结合位点位于24-71氨基酸残基。钙影像实验证明：1、BKCa增强细胞内源性SOCE钙离子内流，2、BKCa增强细胞外源性SOCE钙离子内流，3、2-APB阻断BKCa增强细胞内源性SOCE钙离子内流，4、2-APB阻断BKCa增强细胞外源性SOCE钙离子内流，5、基因敲除Orai1蛋白阻断BKCa增强细胞内源性SOCE钙离子内流；电生理学（膜片钳）显示SOCE可以增强BKCa的活性。功能性研究表明CPA能增强大鼠主动脉环收缩力，Orai1通道阻断剂Gd3+和TICPP显著降低此增强作用。结论：BKCa与SOCE可形成正反馈回路，增大胞内钙离子浓度：SOCE引起的钙内流可增强BKCa的活性，使细胞超极化，超极化使得膜电位增大，增大的电势差有利于钙离子通过SOCs内流。