小G蛋白Rab对血管平滑肌细胞BKCa通道蛋白膜转运的调节及其机制研究

Large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) are broadly expressed in vascular smooth muscle cells (SMCs) and play a crucial role in regulating the vascular tone. After being synthesized and processed in endoplasmic reticulum and golgi apparatus respectively, BKCa protein should be transported to the plasmic membrane to take physiological function with complicated mechanisms. As one member of the small GTPase family, Rab expresses extensively in the intracellular membrane and subcellular compartments with the role of regulating signal transduction, vesicle transportation and ion channel's activity. Taken previous research which demonstrating that Rab participated in the trafficking of BKCa, we propose to further investigate the mechanism that Rab,together with some cofactors, regulates BKCa through the pathway of endoplasmic reticulum to golgi apparatus and plasma membrane as well as cycling in the membrane(endocytosis and recycling into the membrane). To confirm this hypothesis, multiple biological methods will be used including FRET, confocal, flow cytometry, electrophysiology and immunoelectron microscopy labelled with gold. These researches aim to reveal the membrane trafficking mechanism of BKCa and it will be of great value for the regulation of vascular smooth muscle.

大电导钙激活钾通道（BKCa）是血管平滑肌细胞膜上的主要离子通道，在血管舒缩功能调控中起重要作用。BKCa通道蛋白在内质网合成、高尔基体加工后，需经过一系列复杂机制转运并组装到质膜上，才能发挥生理功能。小G蛋白家族成员Rab在质膜内侧及多种胞内囊泡结构中存在，具有调节细胞信号转导、囊泡转运和离子通道活动等功能。本项目是在我们前期研究提示Rab参与BKCa通道蛋白质膜转运的工作基础上，拟采用荧光共振能量转移、共聚焦显微成像、流式细胞术、电生理（膜片钳）和胶体金免疫电镜等多种技术，以Rab为点、BKCa通道蛋白转运的三个主要过程为线，研究Rab在一些辅助因子（磷脂酰肌醇等）的帮助下，对BKCa通道蛋白内质网-高尔基体-质膜转运及细胞膜循环（内吞和再循环插入到细胞膜）时空特性的调控作用及机制。该研究对于阐明BKCa通道蛋白细胞膜转运机制和血管平滑肌的功能调控有着重要理论意义。

大电导钙激活钾通道（BKCa）是血管平滑肌细胞膜上的主要离子通道，在血管舒缩功能调控中起重要作用。BKCa通道蛋白在内质网合成、高尔基体加工后，需经过一系列复杂机制转运并组装到质膜上，才能发挥生理功能。因此，调节血管平滑肌BKCa通道转运过程及其在疾病状态（如高血压等）下的异常机制具有重要意义。小G蛋白家族成员Rab在质膜内侧及多种胞内囊泡结构中存在，具有调节细胞信号转导、囊泡转运和离子通道活动等功能。本项目采用共聚焦显微成像、流式细胞术、电生理（膜片钳）和分子和细胞生物学等多种技术，研究BKCa通道蛋白转运的三个主要过程及其调节机制，包括Rab小G蛋白、磷脂酰肌醇（PIP2）与磷脂酰肌醇激酶（PI4Kβ），丹参酮磺胺酸二钠（DS-201）对BKCa通道转运过程的影响及机制，以及高血压/老龄状态下BKCa通道的异常调节机制，研究结果表明研究小G蛋白Rab4/5/11可以明显调节B细胞膜KCa通道的转运过程；PI4Kβ一方面可以通过增加PIP2量，进而直接激活BKCa通道，另一方面PI4Kβ也可明显促进BKCa通道向细胞膜的转运过程，而BKCa通道可以和PIP2，PIP3等多种磷脂酰肌醇直接结合；作为活血化瘀中药的重要成分DS-201除可以调控BKCa通道的电生理学特性外，包括电压依赖性，钙离子敏感性等，更为重要的是，DS-201可以直接作用于BKCa通道的α亚单位，促进α亚单位向细胞膜的转运过程以及稳定BKCa通道α亚单位在细胞膜上的表达；而高血压和老龄状态下BKCa通道的转运过程存在异常，但其机制还待进一步研究。因此，本项目的实施丰富和进一步完善了BKCa通道蛋白细胞膜转运机制和血管平滑肌的功能调控。同时，本项目建立的多种技术联合应用研究离子通道转运平台为其他离子通道转运调控研究提供了良好借鉴。