枸杞果实糖代谢关键基因的分离及表达研究

枸杞是我国传统的名贵中药材，其药用品质主要决定于果实中糖分的含量和种类。以宁杞1号和宁杞3号枸杞为材料，分别构建不同发育时期果实的抑制差减文库， 再进行大量EST测序，经生物信息技术分析获得果实发育过程中基因的背景信息，揭示枸杞果实发育与糖代谢关键基因表达的关系。克隆获得2-3个糖代谢关键基因，对其时空表达模式及在不同栽培因子下的表达模式进行分析，并转化大肠杆菌和拟南芥以确定基因的功能，从分子水平探索不同品种枸杞果实糖代谢基因表达的差异，为枸杞果实品质形成的分子生物学机制研究奠定理论基础。

本项目立足枸杞果实发育过程中，糖的种类和含量组成不断变化，影响果实品质形成这一重要环节潜在的对农业生产的指导及应用前景，针对枸杞糖类物质形成分子机制了解甚少的现状，以宁杞1号和宁杞3号枸杞为材料，分别构建抑制差减文库，挑选大于300bp以上插入片度克隆进行测序，获得1051个高质量的ESTs序列，拼接成150个contigs，504个singlets，654个Unigenes，根据GO、COG和KEGG功能分类显示654个Unigene。参与为氨基酸代谢、翻译核糖体结构、生物合成、蛋白质折叠，水解、转录调控、电子传递、细胞组织结构等20个代谢类别，获得枸杞果实发育基因表达谱。确定了枸杞蔗糖代谢关键酶作为目标基因， 通过RT-PCR以及RACE方法获得了LbSAI、 LbSPS、LbSusy基因的cDNA全长。mRNA表达分析表明LbSAI在花和果柄中优势表达，而在果实、叶中的表达量较低，而在茎和根中表达较少，其可能主要参与果实中己糖的合成；LbSPS基因在枸杞花和果柄中表达高，而在果实和根表达较少, 在叶和茎中的表达量很低，主要参与果实中碳水化合物的分配；LbSusy主要在枸杞茎和果柄中优势表达，叶和果实中的表达量较低，而在根和花中优势表达量很低，可能主要参与维管束物质的运输，水分对3个目标基因的表达均有显著影响，说明LbSPS、LbSAI、Lb Susy基因在枸杞果实发育过程中协同调控，对其品质形成的具有重要作用。构建LbSPS、LbSAI、Lb Susy RNAi表达载体和Lb Susy超表达载体，利用花粉管通道法转化拟南芥表明，干涉后LbSPS、LbSAI基因在拟南芥中的表达受到部分抑制Lb Susy表达则完全被抑制，对Lb Susy基因在拟南芥中进行过表达转化，应用PCR和Southern技术对后代进行了分子鉴定，在获得的17株成苗中，共鉴定出9株转基因植株，转化效率为53%。 对照和T1代转基因植株生长势进行观察，转基因植株生长势发生变化，说明LbSPS、LbSAI、LbSusy基因对生长具有重要的作用。以上研究结果为通过分子育种途径人为调控枸杞果实品质提供了新的基因原件，丰富了枸杞基因背景信息，为阐明枸杞果实品质形成的分子机制打造了理论基础及技术平台，为更广泛了解茄科植物生长发育机制增加了新的思路，对进一步开发利用枸杞这一植物资源具有理论意义应用价值。