红平红球菌二苯并噻吩脱硫“4S”途径的转录调控研究

Sulfur oxides released from sulfur-containing fossil fuels combustion contribute to acid rain, which causes harm to human health and environmental pollution. Development of deep desulfurization to produce cleaner fuels using biodesulfurization is of great significance. Sulfur-specific “4S” pathway for DBT desulfurization and its genetic and biochemical mechanisms have been documented in detail; however, the regulatory mechanism has not been reported. In this project, using Rhodococcus erythropolis XP as the research object, we plan to confirm the transcription start site of gene cluster dszABC by 5’RACE, the promoter region and to identify its cis-regulatory elements using DNase I footprinting. With the combination of DNA affinity pull-down and genome analysis of R. erythropolis XP, we will identify the transcriptional regulatory factors, and study their functions by constructing gene disruption mutants. We further investigate the interactions between the cis-regulatory elements and regulatory factors, using electrophoretic mobility shift assay, to reveal the regulatory mechanism of “4S” pathway for DBT desulfurization. The research will help us to a more comprehensive and in-depth understanding of the “4S” pathway for DBT desulfurization and provide new knowledge and experimental references for the wide application of biodesulfurization.

化石燃料中的含硫化合物燃烧产生大量的硫氧化物，造成酸雨，直接危害人体健康和破坏生态环境。生物脱硫实现燃料的清洁化生产具有极为重要的意义。专一性破坏二苯并噻吩中C-S键的“4S”途径及其中的脱硫基因簇dszABC、脱硫酶的理化性质等都已阐明，但是转录调控方面的研究却开展得很少。本项目以高效脱硫菌——红平红球菌XP为研究对象，拟通过5'RACE系统验证脱硫基因簇dszABC的转录起始位点，鉴定启动子区，利用DNase I足迹技术鉴定顺式调控元件；利用DNA affinity pull-down实验结合菌株XP的基因组信息，全面筛选转录调控因子；并利用凝胶阻滞实验研究顺式调控元件和转录调控因子的相互作用，揭示“4S”途径中脱硫基因簇dszABC的转录调控机理。该研究有助于我们更加全面深入的理解脱硫“4S”途径，为生物脱硫技术广泛应用提供新的认识和实验依据。

化石燃料中的含硫化合物经燃烧产生大量的硫氧化物（SOx），直接危害人体健康和破坏生态环境。燃料的深度脱硫是实现燃料清洁化生产，满足日益严格环保法规要求的有效方法。生物脱硫具有高效、节能、低耗的优势，具有广阔的应用前景。生物脱硫的“4S”途径专一性断裂C-S键，不影响燃料的热值，是研究的热点。“4S”途径是“硫饥饿”诱导型的，即当无机硫（如硫酸盐和半胱氨酸等）存在时脱硫菌优先利用无机硫生长，脱硫酶DszABC的合成受到阻遏，二苯并噻吩（DBT）不被利用；当优先利用的硫源不存在或不充足的条件下，能以DBT为硫源，诱导合成脱硫酶。.DBT脱硫“4S”途径中脱硫酶的转录表达过程存在着复杂且重要的调控，而有关脱硫基因簇转录调控方面的研究却开展得很少。DBT脱硫“4S”途径中脱硫基因簇dszABC的转录调控机理究竟如何？仍是一个悬而未决的问题，这也是本项目需要解决的问题。.本研究中，我们成功改造了两个大肠杆菌-假单胞菌穿梭的启动子筛选质粒，使之成为大肠杆菌-红球菌穿梭质粒，分别可在转录水平和翻译水平检测启动子的活性。在红平红球菌XP中成功检测到基因簇dszABC上游非编码区包含启动子活性，且为DBT诱导型启动子，并发现基因簇dszABC上游576 bp的启动子活性明显高于385 bp，推测存在参与调控的元件。采用生物信息学分析等方法筛选到了一些候选调控因子，通过基因插入失活进行了基因功能验证。另外，通过文献调研，我们发现红球菌中的硫饥饿诱导效应可能与含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）的合成代谢有关。我们对红平红球菌XP的全基因组序列进行了分析，结合KEGG数据库，推测了菌株XP中的硫代谢途径及含硫氨基酸的合成途径。从中，选取了4个可能使得含硫氨基酸代谢发生改变的酶的基因，对其进行基因失活来研究含硫氨基酸合成途径与Dsz脱硫酶的硫饥饿诱导机制之间的关系，以阐明革兰氏阳性脱硫菌中的硫饥饿诱导机制。该项目对“4S”途径中脱硫基因簇dszABC的转录调控机理的研究具有普遍性的意义，也有助于加深我们对DBT脱硫“4S”途径的理解，提高脱硫活性。