完全降解萘的大肠杆菌工程菌的构建及其代谢机理解析

Naphthalene, the simplest polycyclic aromatic hydrocarbon, exists widely in the environment and poses a serious threat to human health. Biodegradation is a potential low-cost and environmentally friendly approach to contamination remediation. It is difficult for the known naphthalene-degrading bacteria to meet the diverse needs of environmental conditions and remediation methods. This problem will be solved by constructing engineering bacteria for naphthalene degradation which meet different requirements via biotechnology. Therefore, this study intends to construct a naphthalene complete degradation pathway with 17 genes by using synthetic biology technology. And the artificial degradation pathway was transformed into Escherichia coli. Naphthalene can be completely degraded into the tricarboxylic acid cycle of the engineering strain via the artificial pathway. The degradation efficiency, metabolic changes and genetic stability of engineering bacteria will be studied. The colonization ability and remediation effect of engineering bacteria in contaminated soil will be analyzed. This study will prove that artificial degradation pathway composed of several functional genes from different sources can endow the host with the ability to degrade organic pollutants by scientific and reasonable design. This study provides theoretical and technical support for the artificial construction of organic pollution remediation engineering organisms by synthetic biological means.

萘作为一种结构最简单的多环芳烃类有机污染物，广泛存在于环境中，严重威胁人类的健康。微生物降解是一种极具潜力的低成本、环境友好的污染修复方式。目前已发现的萘降解菌难以满足环境条件和修复方法的多样化需求。通过生物技术构建符合不同需求的萘降解工程菌，将在很大程度上解决这一问题。因此，本研究拟以大肠杆菌为模式生物、以完整的代谢途径为操作对象，通过合成生物学技术构建一个包含17个基因的萘完全降解途径，赋予大肠杆菌完全降解萘的能力。工程菌可以将萘通过13步连续的酶促反应完全降解，产物进入三羧酸循环而为工程菌所利用。并对工程菌的降解效率、自身代谢变化、遗传稳定性、污染土壤中的定殖能力及修复效果进行详细分析。本项研究一旦完成，将证明通过科学合理的设计，可以按需要将不同来源的功能基因组装成人工代谢系统，赋予宿主降解有机污染物的能力，为通过合成生物学手段构建有机污染高效修复工程生物提供理论和技术支持。

萘是一种结构最简单有多环芳烃类有机污染物。尽管目前已经从自然界中分离并纯化了一系列萘降解菌，但仍不能满足多样化的污染修复需求。本研究成功在模式生物大肠杆菌中构建了一个萘的完全降解途径。该人工途径包含17个来源于不同微生物的功能基因，并对它们按统一原则进行了结构优化。工程菌可以将萘最终降解为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，避免了因底物不完全降解而造成的中间产物二次污染。采用单顺反子的表达模式为每个功能基因都连接上了独立的T7启动子和终止子。上游代谢模块pET-nahA-G由10个来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida G7的基因组成，能够将萘转化为邻苯二酚。下游代谢模块pCA-cat由7个分别来源于Rhodococcus species AN-22、Rhodococcus jostii和Pseudomonas putida的基因组成，能够将邻苯二酚完全降解。携带两个代谢模块工程菌BL-nah/cat能够降解萘及其中间产物水杨酸和邻苯二酚，并通过稳定同位素示踪技术进一步验证了其功能。蛋白组分析发现工程菌能有效缓解萘对大肠杆菌造成的胁迫。在最适的降解条件下，工程菌BL-nah/cat可以在4小内降解1mM萘，且可以在12小时内降解污染土壤中95%以上的萘。以上结果说明，构建的工程菌可用于萘的生物修复，单顺反子的表达模式和模块化的组装方式可用于构建复杂的代谢途径，为构建适应不同环境的萘及其它多环芳烃降解工程菌提供了可行思路与技术基础。