基于代谢工程改造的增强型大肠杆菌工程菌的构建及应用研究

In the production of industrial fermentation of Escherichia coli, the problems of microbial contamination and phages infection during fermentation process have been the most concerned topic and an unavoidable problem. By controlling the components of fermentation medium, formamide and phosphite as nitrogen and phosphorus sources, most of the microorganisms in nature are “starved” to death because they can not get nitrogen and phosphorus sources simultaneously, but engineered E. coli can assimilate formamide and phosphite. Furthermore, the CRISPR/Cas system can be introduced to engineered E. coli to endow it with the ability to resist phages. In this project, the formamidase gene and phosphite dehydrogenase gene with high enzyme activity were screened from nature. The influence relationship between different construction ways and the growth of engineered E. coli in auxotrophic MOPS medium will be explored. The influence mechanism of different growth conditions and factors on the growth of engineered E. coli will be elucidated and the universality of engineered E. coli to express exogenous genes will be investigated. The “robust” E. coli through genetic modification becomes the dominant strain in auxotrophic MOPS medium containing formamide and phosphite, inhibiting microbial contamination and phages infection and expressing the enzymes (lipase, oxidoreductase, etc) and using as a catalytic cell to systhesis chiral drug intermediates.

在大肠杆菌工程菌应用发酵生产中，染菌和噬菌体侵染一直是发酵企业最关注和难以避免的问题。通过控制发酵培养基成分，以甲酰胺和亚磷酸盐作为氮源和磷源，自然界中极大多数微生物因不能同时获取氮磷源而被“饿死”，但改造后的工程菌能同化吸收甲酰胺和亚磷酸盐。此外，引入CRISPR/Cas系统至大肠杆菌工程菌，赋予其抵抗噬菌体的能力。本项目从自然界中筛选获得具有酶活较高的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因；探索甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因以不同的方式构建对工程菌在营养缺陷型的MOPS培养基中的生长影响规律；阐明不同生长条件和因素对工程菌的生长影响机制；考察工程菌表达外源基因的普适性。经过基因改造的增强型大肠杆菌工程菌，在营养缺陷型的MOPS培养基中能利用甲酰胺和亚磷酸盐成为优势工程菌，抑制杂菌和噬菌体污染的同时还能高效表达酶制剂（脂肪酶、氧化还原酶等），亦可作为一种催化细胞合成手性药物中间体。

大肠杆菌因其优越的性能，比如繁殖快、遗传操作简单、遗传背景清楚等，是发酵工程中最常用的宿主之一。然而，大肠杆菌在发酵过程中常常发生杂菌污染和噬菌体侵染的严重问题，对工业生产造成很大的经济损失，目前仍缺乏有效的解决策略。本研究首先在具有自主知识产权的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis CS0611中经过转录组学分析、克隆得到甲酰胺酶基因；另外通过菌种筛选得到一株能利用亚磷酸盐的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae strain OU07，并成功克隆了内源亚磷酸脱氢酶的基因。以大肠杆菌为研究对象，通过表达挖掘得到的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶，增加两条新的稀有氮磷源代谢途径(抗杂菌系统)，特点是能专一性催化甲酰胺和亚磷酸盐分别成为铵根离子和磷酸盐作为大肠杆菌生长的氮源和磷源，而其它杂菌均不能利用这两种底物作为氮源和磷源，以防止杂菌污染。在此基础上引入抗噬菌体系统(CRISPR/Cas9)，赋予大肠杆菌工程菌抵抗噬菌体的能力。构建得到的具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌将具有非常巨大的应用潜力。本项目在研究内容、研究成果等方面均超额完成了任务。本项目在研究内容、研究成果等方面均超额完成了任务。以上研究工作已发表一系列高水平论文36篇，其中，SCI收录论文33篇，他引累计400余次，主要刊物为 Chem. Eng. J., Green Chem., ChemSusChem, Biotechnol. Bioeng., ACS Sustain. Chem. Eng., J., Agr. Food Chem.等。申请中国发明专利9项，其中获授权中国专利6项。该研究为现代发酵行业提供一种全新大肠杆菌工程菌株，是发酵工业向“绿色”发酵更近一步，为发酵工业的绿色可持续发展作出一定的贡献和提供理论基础，且具有较好的应用潜力。