青蒿LTP3蛋白参与青蒿素前体物质胞外分泌和积累的机理研究

Artemisinin is widely used for malarial treatment. Whereas, low contents artemisinin supply by isolation from Artemisia annua does not satisfy the global demand. Artemisinin biosynthesis and accumulation are compartmented in different subcellular space, thus the transport, extracellular secretion and sequestration of artemisinin precursors are important steps for artemisinin biosynthesis. Previous studies have shown that ABC transporters could transport the artemisinin precursors across the plasma membrane and then LTP3 might prevent the reflux back to cells. Thus we proposed that LTP3 might play vital roles in extracellular secretion and sequestration of artemisinin precursors. However, how LTP3 works in the extracellular secretion and sequestration of artemisinin precursors is still unclear. Based on the preliminary studies, we would like to explore how LTP3 works in the extracellular secretion and sequestration of artemisinin precursors by exploring the binding activity, transfer activity and extracellular sequestration efficiency via E.coli system, BY-2 cells, yeast systems and transgenic Artemisia annua. This project will elucidate the mechanism of extracellular secretion and sequestration of artemisinin precursors, providing theoretical evidence for metabolic engineering in Artemisia annua or heterologous planta.

青蒿素是被广泛应用的抗疟疾药物，然而其产量远远不能满足市场需求。由于青蒿素合成和积累过程具有区室化的特征，使得青蒿素前体物质的转运、胞外分泌和积累成为青蒿素合成的重要步骤。通过前期亚细胞定位和代谢产物分析发现，ABC转运蛋白参与青蒿素前体物质的跨膜转运后，LTP3可阻止青蒿素前体物质往胞质方向回流。因此，我们提出LTP3可能在青蒿素前体物质的胞外分泌和积累中起关键作用。然而，LTP3参与青蒿素前体物质的胞外分泌和积累机制尚不明确。本项目拟在前期工作基础之上，进一步通过蛋白原核表达、烟草BY-2悬浮细胞、酵母体系和转基因青蒿等实验探究候选LTP3与青蒿素前体物质的结合活性、转移活性及胞外截存效率等，旨在评价和证实LTP3在青蒿素前体物质胞外分泌和积累过程中的作用。本项目的实施有望揭示青蒿素前体物质胞外分泌和积累的机制，为利用代谢工程手段提高青蒿素含量提供科学依据。

青蒿素是被世界卫生组织广泛推荐使用的抗疟疾药物，然而其产量远远不能满足市场需求。由于青蒿素合成和积累过程具有区室化的特征，使得青蒿素前体物质的转运、胞外分泌和积累成为青蒿素合成的重要步骤。前期我们的研究发现了LTP1/3在青蒿素前体物质的胞外分泌中发挥着重要的作用。国外科研工作者通过转基因LTP3青蒿植株，进一步证实了其在青蒿素底物胞外分泌过程中的作用。基于此研究背景之下，我们对青蒿中LTPs家族开展了全基因组检索，获得了8个共表达基因，并鉴定了新的LTPG基因。该基因由糖基磷脂酰肌醇锚定脂质转移蛋白家族基因编码，参与脂肪酸及其衍生物通过亲水细胞壁层输出到植物表面。多项证据表明，LTP在腺毛的萜类化合物积累中发挥作用。然而，LTPG是否影响萜类化合物的积累，以及潜在的分子机制仍然知之甚少。在这里，我们鉴定了一个青蒿LTPG1基因，它在花中高表达且与青蒿素生物合成基因呈正相关。体外使用荧光TNS探针显示，重组AaLTPG1与不饱和脂肪酸的最高结合活性，与青蒿素的前体物质也具有结合活性。AaLTPG1转基因烟草中的萜类化合物和脂质含量均有所增加。但在转基因AaLTPG1烟草中，腺毛的起始、发育和分泌没有改变。通过进一步的转录组测序，我们的结果表明乙烯信号在AaLTPG1过表达烟草植物中受到抑制。与烟草转基因材料的结果一致，青蒿瞬时超表达的叶片中青蒿素及其前体物质均显著性提高，且乙烯响应基因(ERF)的表达水平也在青蒿超表达叶中下调。总的来说，我们鉴定了LTPG基因，其具有转运疏水性物质（包括青蒿素底物）的能力，可能介导于LTP3和PDR2之间；且其所产生的脂肪酸信号可以抑制乙烯信号，从而整调控青蒿素等萜类化合物的积累。这些数据促使AaLTPG1成为改善代谢工程青蒿素积累的潜在理想候选基因。