建立利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学技术鉴定系统性淀粉样变性患者中致淀粉样变性蛋白类型的方法

The systemic amyloidosis is a group of complex diseases caused by tissue deposition of misfolded proteins that result in progressive organ damage. To date, at least 28 different proteins have been identified as causative agents of amyloid diseases. The various forms have overlapping manifestations, which make their differentiation impossible on a clinical basis, without the auxilium of laboratory and pathology techniques. Therefore, accurate and reliable differentiation of the amyloid subentity is of paramount importance, given the widely differing therapies, ranging from chemotherapy for AL amyloidosis to liver transplantation for some hereditary forms. Antibody based methods such as immunohistochemistry is proved to be unreliable for amyloid typing. Therefore, we will establish a novel method for subtyping the amyloidogenic proteins in patients with systemic amyloidosis by laser micro-dissection and mass-spectrometry based discovery proteomic analysis. The sensitivity and specificity of this method will be evaluated in patients with confirmed amyloidogenic proteins and those without amyloidosis. We will document the distribution of subentities in our hospital by analyzing all patients who were diagnosed as systemic amyloidosis during the last 15 years by the usage of laser microdissection and proteomic analysis. This novel method will enhance our ability to diagnose and treat patients with systemic amyloidosis and improve their clinical outcomes.

系统性淀粉样变性是一组异质性疾病，依照致淀粉样变性蛋白的不同可以分为不同的亚型。虽然各种淀粉样变性亚型的临床表现都很相似，但是不同亚型的病因、临床预后以及治疗策略却大相径庭。因此，对系统性淀粉样变性患者进行精确分型是患者接受正确治疗的基础。目前临床常用的组织病理学和免疫组化等分型方法都存在灵敏度低、特异性差的问题。国外近年开始将发现蛋白质组学技术用于鉴定致淀粉样变性蛋白类型，其灵敏度和特异性均高于常规方法。国内目前尚无相关研究。我们拟应用激光显微切割联合发现蛋白质组学技术建立鉴定致淀粉样变性蛋白类型的方法。该方法的建立和应用将显著提高我们诊治淀粉样变性的能力，并有助于改善系统性淀粉样变性患者的预后。

本研究旨在建立利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS)对淀粉样变进行分型的方法。在方法学方面，我们对大鼠经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的显微切割标本进行蛋白提取及质谱蛋白质学测定，以测定到的多肽数、蛋白数、谱图数和蛋白丰度作为裂解液效率的判断标准，发现Zwittergent 3-16是LMD标本质谱分析首选的裂解液。同时应用微波辅助酶切的方法，可以显著缩短样本处理时间。我们还通过临床确诊的淀粉样变阳性对照组标本，证实了emPAI值较目前广为应用的谱图数能更为准确地判断丰度最高的致淀粉样变蛋白。同时，基于淀粉样物质沉积部位的致病蛋白百分比应高于非病变部位，以及致淀粉样变蛋白量高于其他因血液污染而带入的淀粉样变相关蛋白这两个假设，我们设立了P-score及D-score两个指标来判断鉴定结果的可信度。在建立方法之后，我们收集了北京协和医院138例病理确诊为系统性淀粉样变患者的FFPE标本。利用LMD收集刚果红染色阳性区域组织并行质谱蛋白质组学分析，根据丰度最高的致淀粉样变蛋白判定出淀粉样变亚型。在138例组织标本中，腹壁脂肪占26%，舌体占19%，齿龈占11%，肾脏占9%，胃肠道占9%，心脏占6%，其余类型样本占20%。总共121例获得了成功分型，分别为轻链型107例(88.4%)，ATTR型7例(5.8%)，AA型、AH/AL+AH型及AFib型各2例(1.7%)，AApoA-II型1例(0.8%)。5例被排除淀粉样变诊断；12例分型失败。总体诊断准确率为91.3%。在各种组织类型标本中，腹壁脂肪组织的分型成功率最低，仅为83.3%。综上，LMD/MS是一种可靠、有效、快速的淀粉样变亚型鉴定方法。