基于激光显微切割和质谱联用技术的金耳环的有效性及安全性研究

Efficacy and safety is the most important issues in using traditional Chinese medicines. Effective ingredients and its toxic components are present in special herbal cells and tissues. However, the chemical constituents are extracted and isolated by a lot of reagents without considering their histological distribution in traditional studies, and maybe the isolated constituents are changed. In this research, laser microdissection and liquid chromatography will be combined with mass spectrometry to investigate the distribution of effective constituents in herbal cells or tissues of Asarum insigne, which is a substitute of widely-used Radix et Rhizoma Asari. Especially toxic constituents aristolochic acid and aristololactam which were proved nephrotoxic and carcinogenic will be researched. Laser microdissection and gas chromatography will be combined with mass spectrometry to analysis the volatile oils in oil cells distributed in cortex of roots, especially toxic safrole of volatile oils. This research will provide information about chemical basis of the herbal tissues and cells, and investigate the correlation between herbal tissues or cells and effective and toxic constituents, the discipline of distribution in tissues and cells. The results will be helpful for evaluating the pharmaceutical quality and widely using of Asarum insigne in the clinic. This work also established a new, reliable, and practical method for direct profiling and imaging of active constituents in any herbal tissues and cells.

中药的有效性及安全性是中药使用中最重要的问题。中药的有效成分及其内源性毒性成分存在于特定的药材显微组织和细胞之中。传统的天然药物化学研究不考虑化学成分的组织分布特征，提取分离过程经过很多试剂提取，原有的化学成分发生了改变。本项目拟采用激光显微切割技术及液质联用技术直接分析细辛常见代用品金耳环有效成分在药材显微组织及细胞中的分布及含量；采用激光显微切割技术与气质联用技术直接分析金耳环根皮层部位的油细胞中挥发油的成分和含量；尤其是探讨金耳环挥发油中有毒成分黄樟醚、以及药材显微组织中马兜铃酸、马兜铃内酰胺类成分的组织分布及含量特征；探讨金耳环组织特征与有效成份及有毒成分的关系，探讨有效成分及有毒成分的显微组织分布规律。本研究将为金耳环的质量评价及安全应用提供科学理论依据，也为其它中药的组织化学、质量评价研究提供参考。

金耳环（Asarum insigne）全草或地下部分在广西被当做细辛代用品使用。其挥发油具有镇痛和抗炎作用，其中活性成分之一黄樟醚具致癌性，也是毒性物质。金耳环中也含有马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类成分,这类成分具肾毒性，是目前国内外医药界研究的热点之一。本研究采用顶空-（固相微萃取）-气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用技术相结合的方法，对金耳环根、根茎、叶、花各个部位，对金耳环根皮部(包括表皮和皮层)和芯部（维管束），对金耳环根和根茎皮层油细胞进行了有效成分和有毒成分的定性、半定量和定量分析。主要结果如下。.1)采用HS-GC-MS联用方法，分析了金耳环根、根茎、叶、花和全草粉末中的挥发性成分。结果显示金耳环根茎、叶或花中（5/6）含有更多的毒性成分黄樟醚。采用HS-SPME-GC-MS联用方法，首次对金耳环根和根茎皮层油细胞中的挥发性成分进行了定性和半定量研究，共鉴定出55种成分。.2)从金耳环全草70％乙醇提取物中首次分离鉴定出马兜铃内酰胺类化合物4个，内酯1个，分别为马兜铃内酰胺I，9-乙氧基马兜铃内酰胺IV，aristololide，马兜铃内酰胺AII，7-甲氧基-马兜铃内酰胺IV。.3)采用UFLC-MS/MS联用的方法，建立了同时测定金耳环中3个挥发性成分和4个马兜铃内酰胺类成分的含量测定方法，并比较了药材不同部位、不同组织中7种成分的含量。结果显示大多数样品中叶、花和根茎（29/33）含有更高的马兜铃内酰胺I、aristololide、马兜铃内酰胺AII和7-甲氧基-马兜铃内酰胺IV等马兜铃内酰胺类成分。. 本研究采用匀浆-酶解-吸取的方式对金耳环根和根茎皮层油细胞进行了HS-SPME-GC-MS分析，首次采用HS的方式分析金耳环药材粉末中的挥发性成分。这三种方法较传统的植物化学成分分离和挥发油提取方法具有消耗样品少、使用化学试剂少、简单快速等优点。. 本研究首次研究有毒成分黄樟醚、马兜铃内酰胺类成分在细辛常见代用品金耳环的分布部位和含量。研究显示大多数样品叶、花和根茎（34/39）含有更高的马兜铃内酰胺类和黄樟醚，所以金耳环应该以根部来入药，根茎和地上叶和花应该摘除或谨慎使用。本研究为细辛类药材的质量评价提供了依据，为细辛类药材的安全应用提供了数据支持。.