约氏疟原虫甲氟喹抗性的基因定位及功能研究

Malaria remains an important parasitic infectious disease, killing nearly one million individuals worldwide each year, partly due to the comprehensive drug resistance in malaria parasites. Because of extensive use, parasites resistant to mefloquine (MQ), a synthetic analogue of quinine, have been widely reported in Southeast Asia. MQ resistance has also undermined the efficacy of its combination treatment with artemisinin. Unfortunately, the molecular basis of MQ resistance remains largely unknown. Our unpublished studies have shown that P. yoelii NSM strain is resistant to MQ, whereas P. yoelii BY265 is sensitive to the drug. To identify the gene(s) conferring resistance to MQ, we propose to perform genetic crosses using NSM and BY265 parasites and clone progeny from the cross. Cloned progeny will be genotyped with hundreds of microsatellite markers, and their response to MQ will be evaluated to identify genetic locus/loci and candidate genes that may play a role in the resistance. Potential functions of the candidate genes will be evaluated using gene knockout or allelic exchange. Identification of gene(s) that can confer MQ resistance will provide critical information for better combating drug resistance and aid in the design of new effective antimalarial drugs. This study will also develop a rodent model for the investigation of drug resistance.

疟疾仍是危害人类健康的重要寄生虫病，全球每年近100万人因患疟疾死亡，部分原因归咎于抗药性疟原虫的出现和扩散。甲氟喹是一种喹啉类药物，已广泛用作青蒿素复方的伴侣药物。遗憾的是，抗甲氟喹的疟原虫在东南亚已有大量报道，抗性的产生也削弱了甲氟喹作为伴侣药物的青蒿素复方的药效，且甲氟喹抗性的分子机制仍未阐明。我们前期的研究工作证实，约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）NSM是甲氟喹抗性虫株，而BY265为甲氟喹敏感性虫株。本研究拟使用虫株NSM和BY265构建遗传杂交，克隆杂交子代、对重组子代进行微卫星基因分型，分析重组子代的抗药性和遗传分离模式以鉴定控制疟原虫甲氟喹抗性的基因座位和候选基因，并使用基因敲除、或等位基因位点替换的技术对候选基因的功能进行研究。鉴定潜在的甲氟喹抗性基因不仅有助于揭示疟原虫的抗药性机制，而且能为我们研制新型抗疟药，特别是为开发新的组合药物提供新的思路。

全球每年有超过50万人因患疟疾死亡，抗药性问题仍是人类进行疟疾防治的主要难题。甲氟喹是一种喹啉类药物，已广泛用作青蒿素复方的伴侣药物。遗憾的是，抗甲氟喹的疟原虫在东南亚已有大量报道，抗性的产生也削弱了甲氟喹作为伴侣药物的青蒿素复方的药效，且甲氟喹抗性的分子机制仍未阐明。本项目通过构建约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）遗传杂交和RNA深度测序的方法对疟原虫甲氟喹抗性的分子机制进行探讨。.我们采用约氏疟原虫甲氟喹抗性虫株NSM和敏感性虫株BY265成功构建了遗传杂交组，分离获得45个独立的重组子代，并建立该杂交组的遗传图谱。NSM X BY265杂交组的总遗传距离与我们之前报道的约氏疟原虫遗传图谱的总遗传距离基本相似，总遗传距离值分别是514.6 和579.2 cM。后续的测药实验结果显示杂交子代并没有通过遗传得到亲本虫株NSM的甲氟喹抗性，这说明NSM其甲氟喹抗性可能是由基因表达水平的调控引起的。因此，接下来我们对NSM未经和经甲氟喹处理的红内期原虫cDNA样本文库进行了深度测序，将深度测序序列和YM虫株的cDNA序列进行比对以鉴定基因编码区的单核苷酸多态性SNPs、以及比较在甲氟喹压力下基因表达的差异。通过RNA深度测序，我们获得了~5.6 X 10E7个100 bp的测序序列，总测序覆盖度为~225倍。与YM的基因结构进行比对，我们发现了新的转录基因和转录剪接。其中包括：5’UTR内含子和3’UTR内含子，错误的内含子/外显子边界，选择性剪接，正义链和反义链转录的重叠，新预测的基因转录等。UTR内含子的发现提示其具有调节疟原虫基因表达的潜在功能和作用。比较未经和经甲氟喹处理的NSM虫株间的基因表达水平，发现在甲氟喹的作用下5个编码基因的表达有显著上调。我们还不清楚这些差异表达的基因在虫株的甲氟喹药物反应中起什么作用，目前，我们正着手进行与此方面相关的功能性实验研究。