紫娟茶树调控花色苷生物合成的MBW转录因子复合体研究

MYB-bHLH-WD40 (MBW) transcription factor complex has been found to be central to regulation of biosynthesis of anthocyanin and related flavonols in plants; however, the MBW complex in tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze）] is unknown. In this project, we are planning to study the MBW complex controlling anthocyanin biosynthesis in C. sinensis based on that transcription factors possibly regulating anthocyanin synthesis have been identified through RNA-seq analysis of tea leaves with different contents of anthocyanin. We design to study the MYB, bHLH and WD40 transcription factors regulating anthocyanin synthesis by RACE, Real-time PCR, and transgenic technology, respectively. We will investigate the MBW complex by approaches comprised of yeast two-hybrid, Co-Immunoprecipitation and mass spectrometry. We attempt to identify the target genes of MBW complex using chromatin immunoprecipitation assay. The MBW complex controlling anthocyanin biosynthesis and the target genes of this complex will be identified through the development of this project. And novel knowledge about the biosynthesis and regulation of tea secondary metabolites will be revealed. The mechanism for the accumulation of anthocyanin in Zijuan tea cultivar will be demonstrated at transcription regulation level, and theoretical basis for the breeding of purple tea cultivar with high content of anthocyanin will be provided. Through the development of this project, technical support for further study of the MBW complexs regulating biosynthesis of catechins and related flavonols in C. sinensis will be provided.

植物花色苷等类黄酮化合物生物合成主要由MYB、bHLH和WD40转录因子形成的MBW转录复合体调控，但茶树MBW转录复合体未见研究。项目拟在前期通过对花色苷含量不同叶片的RNA-seq研究，发现了可能调控茶树花色苷生物合成转录因子的基础上；应用RACE、Real-time PCR和转基因技术研究鉴定调控茶树花色苷生物合成的MYB、bHLH和WD40转录因子；应用酵母双杂交、免疫共沉淀和质谱技术研究鉴定调控茶树花色苷生物合成的MBW转录复合体；应用染色质免疫沉淀技术研究MBW转录复合体特异调控的靶基因。通过项目研究将发现调控茶树花色苷生物合成的MBW转录复合体，阐明其调控的靶基因，获得茶树次生代谢物生物合成与调控的新知识；将从转录调控的层面认识紫娟茶树花色苷累积分子机制，为富含花色苷茶树品种的选育提供理论基础，为进一步研究调控儿茶素等其他类黄酮化合物生物合成的MBW转录复合体提供技术支撑。

为了探明调控茶树花色苷生物合成的MYB、bHLH和WD40转录复合体(MBW)，本项目开展了以下5方面的工作：（1）基于多组学的茶树转录因子研究，（2）茶树MBW转录因子复合体研究，（3）CsaMYB4和CsaMYB5 的DNA亲和测序（DAP-seq）研究，（4）茶树类黄酮合成基因表达量与物质含量相关性研究，以及（5）紫娟与云抗10#新梢类黄酮生物合成基因转录本的可变剪接事件分析。以紫娟紫色嫩叶、绿色成熟叶和云抗10#绿色嫩叶为材料，通过Illumina HiSeq测序，组装得到78915条Unigenes，应用LC-MS/MS技术鉴定到7064个蛋白，应用实时单分子DNA测序技术分别在紫娟和云抗10#中得到73856和83264条全长转录本。序列分析发现了可能调控花色苷生物合成的5个bHLH和8个MYB转录因子，研究了这13个转录因子基因在11份材料中的表达情况，克隆得到10个转录因子序列。互作分析与文献报道认为CsaMYB6-1、CsabHLH5-3与CsaTTG1，CsaMYB5、CsabHLH5-1与CsaTTG1可能分别形成MBW复合体，调控花色苷生物合成。通过DAP-seq研究，发现了CsaMYB4和CsaMYB5调控的靶基因，包括PAL、4CL、CHI、CHS、ANR、LAR、ANS和UGT75L12等花色苷合成基因。应用qRT-PCR研究了24份样品中，34个茶树花色苷生物合成关键基因表达量与儿茶素、花青素含量的相关性，发现一些与花色苷含量相关的基因，克隆得到其中13个基因。分析发现类黄酮途径上有96个基因发生可变剪切事件，产生了333个isoforms。相关性分析显示4C、ANR、ANS、CYP98A3/C3H、C4H、CHI、DFR、F3’5’H、FLS、LAR、PAL、CCR、CYP73A13、UDP75L12、UDP78A15、UDP94P1、CHS、CCOM、GL3、F3H和MYB113等基因及其可变剪切转录本表达与类黄酮物质含量显著相关，提示转录本可变剪切参与花色苷生物合成调控。项目资助发表论文16篇（SCI收录论文5篇），申请发明专利1项，获授权发明专利1项，培养硕士研究生3人。