普洱茶固态发酵过程酶组成与来源的蛋白质组研究

微生物胞外酶是普洱茶化学成分转化的主要生化动力，其多样性与不可控性，是普洱茶产品质量不稳定的直接原因。已有应用显色、同工酶电泳等方法针对酶活性及酶活与微生物数量相关性的研究，未阐明普洱茶发酵过程酶的组成与来源，严重制约了普洱茶基础研究和工艺创新。本项目拟将蛋白质组学和生物信息学引入传统普洱茶发酵，研究发酵过程酶的组成与来源。拟提取普洱茶工业发酵样品的胞外酶，双向电泳分析、质谱和数据库检索鉴定蛋白，研究酶的组成；拟在已建立无菌普洱茶固态发酵模型可控发酵微生物的基础上，开展工业发酵与单一菌种发酵样品的比较蛋白质组和生物信息学分析，研究酶的来源。项目可在组学水平揭示普洱茶固态发酵过程酶的组成，从酶的角度认识普洱茶发酵，完善普洱茶发酵理论；可揭示发酵过程酶的来源，发现主要酶及产生菌，为酶和微生物在普洱茶品质形成机理研究和加工工艺创新方面应用奠定基础；可拓展普洱茶消费，促进普洱茶和云茶产业健康发展。

微生物产生的酶是普洱茶化学成分转化的主要生化动力，但已有研究未阐明酶组成与来源。基于此，项目应用宏基因组和宏蛋白组学技术研究普洱茶发酵过程微生物酶组成与来源，开展了以下3项研究。.1.实验室普洱茶发酵过程微生物酶组成与来源研究.收集了12个实验室发酵样品，应用分光光度法和高效液相色谱法探明了发酵过程茶多酚等成分的变化规律。通过454 pyrosequencing测序与生物信息学分析，阐明了发酵过程细菌与真菌群落结构与动态变化；应用2-D结合质谱的宏蛋白组学技术初步阐明了发酵样品微生物酶的组成与来源，应用LC-MS/MS技术阐明了发酵21d样品微生物酶组成与来源。.2.工业普洱茶发酵过程微生物酶组成与来源研究.收集了2个批次共18个的工业普洱茶发酵样品，探明了发酵过程茶多酚等化学成分的变化规律。应用Illumina MiSeq技术分析发现原料、发酵初中期优势细菌是肠杆菌科细菌，发酵后期优势菌是芽孢杆菌；原料和发酵初期的优势真菌是曲霉属真菌，发酵中后期Rasamsonia繁殖，与曲霉属共同成为优势真菌。通过蛋白提取、酶解、LC-MS/MS测定以及数据库检索的宏蛋白组学研究，分别从发酵样品中鉴定到20-220个细菌蛋白和171-1468个真菌蛋白，阐明了发酵过程酶的组成；关联分析发现曲霉属真菌既是优势菌也是主要的酶产生菌，揭示了酶的来源。.3. 单一菌种发酵茶叶微生物酶的组成研究.分别将黑曲霉、溜曲霉、烟曲霉、微小根毛霉和 Blastobotrys adeninivorans共5种发酵优势真菌接入液体（茶汤）和固体茶叶培养基发酵，经LC-MS/MS鉴定到9-1678蛋白，阐明了这些优势真菌在茶叶基质上产生的酶，证实了发酵过程酶的组成与来源。.综上，本项目阐明了3次普洱茶固态发酵过程微生物酶的组成，完善了普洱茶发酵加工理论；揭示3次普洱茶固态发酵过程酶的来源，发现了主要酶和产生菌，为应用微生物与酶，改进工艺或进一步研究普洱茶发酵机理提供了基础；并发现了与茶叶软化、醇和儿茶素氧化有关的酶，为普洱茶发酵机理提供了新的理论知识。.项目成果在Scientific Reports 等期刊发表论文7篇（SCI收录论文3篇），会议论文6篇，做会议报告6次。培养硕士研究生4名。项目期间主持人遴选为硕导、晋升副高职称、获中国茶叶学会青年科技奖。