线粒体基因突变和喉癌发生发展关系的研究

在多种人类肿瘤细胞中，线粒体DNA具有高突变率和高拷贝数的特点，而在头颈肿瘤中尤以线粒体D-loop区的突变频率最高。在本研究中，我们将在癌前病变和原发喉癌组织中检测线粒体D-loop区的突变，进行以PCR为基础的直接测序，检测各种组织的突变频率，寻找高频突变及热点突变部位，分析突变的特点与喉癌发生发展及预后的关系。利用筛选的高频热点突变和我们培养成功的独一无二的无线粒体喉癌细胞株构建突变型和野生型的转染线粒体的融合喉癌细胞株并接种裸鼠。通过对几种融合细胞的线粒体功能检测，包括线粒体膜电位、ROS产生、ATP合成、cytochromeC释放及细胞凋亡状态的检测，探讨线粒体D-loop突变对线粒体功能和喉癌细胞凋亡的影响及线粒体突变对喉癌细胞表型的作用，阐明我国喉癌发生发展中的线粒体的基因改变的特点，证实线粒体缺陷是喉癌发生的机制之一及线粒体基因突变的检测作为喉癌发生早期的分子检测手段。

肿瘤的早期发现和早期治疗是提高肿瘤患者生存率和生存质量的重要因素，寻找具有肿瘤特异性和敏感性的喉癌分子标志物是早期发现肿瘤的重要手段。很多肿瘤中都发现线粒体DNA突变。线粒体DNA易于受到氧化损伤而突变增多，烟草是典型的DNA损伤剂，这种改变可能发生在肿瘤进展的早期。而喉癌的病因是大量吸烟。线粒体的D-loop区是线粒体基因的调控区，是线粒体DNA突变的高发位点。线粒体通过氧化磷酸化过程产生ATP为细胞供能，同时产生氧自由基（ROS）。慢性ROS接触可以对线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体功能障碍，反过来促使ROS增多，加重线粒体DNA损伤。.　　我们利用PCR为基础的直接测序，筛查原发喉癌组织和对照正常咽喉粘膜的线粒体D-loop区的突变位点，找出与喉癌组织相关的线粒体突变位点，计算突变发生频率和部位，分析突变特点。结果显示，在原发喉癌组织中有高频率的体细胞性突变和多态性变异，喉癌组织中有50.8%（31/61)突变，分布集中在HVR I和HVR II部位的59个核苷酸位点, 主要是碱基的替换，绝大部分突变为同质性，只有5例为异质性突变。65.6%的喉癌患者发现多态性改变，线粒体转录因子结合位点D310区的303－309的C-tract区的不稳定发生率较高。同时，用线粒体去极化剂valinomycin处理三种喉癌细胞系和对照细胞系HL-60经过valinomycin处理后，用细胞膜电位探针JC-１染色和凋亡特异性探针annexinV染色，用流式细胞仪分别测量它们的线粒体膜电位和凋亡率。western印记用来检测细胞浆内的细胞色素Ｃ的释放。在经过24小时的处理后所有细胞均显示完全的线粒体去极化，只有HL-60细胞出现凋亡和细胞色素Ｃ释放，而喉癌细胞系没有出现。另外我们利用EB处理喉癌细胞系，使之成为敲除线粒体的喉癌细胞系。人喉癌细胞系JHUo11在加入溴化乙锭（EB）的培养基中培养以去除线粒体DNA，经过四个月培养，PCR未扩增出线粒体DNA条带，健那绿染色鉴定成功培养出独有的喉癌ρ0细胞。总结研究结果我们发现喉癌的mtDNA D-loop是一个具有高频突变率和高度多态性的不稳定区域，可能在喉癌的发生、发展过程中起作用，线粒体突变的检测可能成为喉癌早期诊断的分子标准物。喉癌细胞系表现出线粒体凋亡途径的缺陷，线粒体DNA突变及功能障碍可能是喉癌发生的原因之一。