基于细菌多重耐药外排泵转运子AcrB及其调控系统研究青蒿琥酯的抗菌增敏作用机制

过度表达的药物外排泵是革兰阴性菌产生多重耐药性的最重要机制之一。基于我们前期研究发现青蒿琥酯（AS）可增加抗生素对大肠埃希菌的抗菌作用、该作用与外排泵转运子（AcrB）密切相关的工作基础，本项目拟在AcrB蛋白、acrB基因操纵元及基因调控子三个水平进行研究，以明确AS究竟是通过直接与AcrB蛋白结合、还是直接与操纵元基因结合而抑制其表达、还是影响acrB基因表达调控子而发挥作用。首先，采用DPI检测系统分析AS和AcrB蛋白之间的相互作用，明确AS是否通过与AcrB蛋白结合而发挥作用。其后，采用DPI系统，明确AS是否通过与acrB操纵元结合而抑制相关基因的表达。然后，采用基因芯片筛选受AS影响的调控子，确认其真实性、确定重要调控子；再采用反义寡核苷酸封闭该调控子基因、构建该基因缺失细菌株，观察AS抗菌增敏作用的改变，阐明AS对acrB基因表达调控子的作用。综合分析，阐明AS的作用机制。

前期研究发现抗菌增敏剂青蒿琥酯（artesunate，AS）可逆转大肠埃希菌耐药，其作用机制与抑制大肠埃希菌重要多药外排泵转运子AcrB表达有关。本研究拟进一步对AS抑制AcrB的分子机制进行探讨。本研究主要进行了如下工作：在acrB操纵元水平，采用双偏振干涉法和等温量热滴定法检测其是否通过结合操纵元而影响acrB表达；在acrB调节子水平，首先采用生物信息学分析筛选重要acrB调节子，real-time PCR明确AS单用和联用三种β-内酰胺类抗生素是否抑制acrB及其调节子表达，然后在调节子基因敲除菌株中明确AS抑制acrB表达的作用靶点；最后采用分子对接和生物传感器技术明确青蒿琥酯与靶点的相互作用细节。本研究发现：亲和力实验结果显示AS并不结合acrB操纵元转录激活区、终止子、acrA及acrB基因，提示其不通过影响操纵元而抑制acrB表达；基因相互作用网络分析提示三联正向调节子marA-rob-soxS为acrB基因的核心调节子；AS单用和联合三种β-内酰胺类抗生素均显著抑制acrB及其正向调节子marA-rob-soxS的表达；AS的抗菌增敏作用在marA-rob-soxS联合敲除菌和marA敲除菌中完全消失，在rob、soxS敲除菌中部分消失，提示marA更为关键；亲和力实验和生物信息学分析表明AS并不结合marA-rob-soxS DNA序列，而是结合MarA蛋白DNA结合面的中央凹陷，通过改变其表面电荷分布，从而抑制marA-rob-soxS调节子对marA和acrB基因的转录激活作用。本研究结论为：AS通过结合MarA蛋白而抑制acrB正向调节子marA-rob-soxS的表达，从而减少多药外排泵转运子AcrB的表达，发挥其抗菌增敏作用。因此，青蒿琥酯可以作为marA-rob-soxS靶向的细菌药物外排泵抑制剂，用于抑制AcrB功能而发挥抗菌增敏作用。