青蒿琥酯上调巨噬细胞抗菌性自噬作用的机制研究

Antibacterial autophagy is an essential host immune pathway for combating infection. It is important to find regulatory agents of autophagy with elucidated mechanisms. We have found previously that Artesunate (AS) could upregulate antibacterial autophagy in murine macrophages, while the mechanism is unclear. We supposed in this study that AS exert such a function via induction of reactive oxygen species (ROS) and / or increase of intracellular calcium levels, which activate mTOR and Beclin1, two key regulatory molecules in autophagy. We designed the following experiments to testify the hypothesis. First, levels of ROS and its regulatory factors (NOX2), calcium concentrations its regulatory factors and activation of mTOR and beclin in macrophages after AS incubation will be detected. Then we wll adjust the ROS levels the Ca2+ levels separately to observe whether the antibacterial autophagy is affected. The regulatory mechanism of AS induced antibacterial autophagy will be elucidated with results obtained from the above experiments, which may provide useful data for the development of novel anti bacteria stratery based on host immune functions.

抗菌性自噬是机体应对病原体感染的重要途径，寻找调节药物并阐明作用机制具有重要意义。本课题组前期研究发现青蒿琥酯（AS）可上调小鼠巨噬细胞的抗菌性自噬，但机制不明。结合AS的药理特性（诱导NOS释放和上调Ca2+水平）和自噬发生的分子调控机制（mTOR和Beclin1的活化），本项目提出AS通过活性氧和/或Ca2+途径激活关键分子mTOR和Beclin1，进而上调抗菌性自噬的假设。为证实该假设，首先检测AS作用后巨噬细胞ROS水平和ROS通路重要蛋白表达、Ca2+浓度和Ca2+通路重要蛋白活化以及mTOR以及beclin1的活化，进而改变ROS和Ca2+水平，观察对AS诱导mTOR和beclin1的活化以及杀菌性自噬作用的影响。最终明确ROS途径和Ca2+途径在AS上调巨噬细胞杀菌性自噬功能中的调控机制，为基于机体自身免疫功能的抗菌策略研究提供新的思路。

抗菌性自噬是机体应对病原体感染的重要途径，寻找调节药物并阐明作用机制具有重要意义。本项目基于前期有关青蒿琥酯（AS）上调小鼠巨噬细胞抗菌性自噬的研究发现，结合AS的药理特性和自噬发生的分子调控机制，提出“AS通过活性氧和/或Ca2+途径激活关键分子mTOR和Beclin1，进而上调抗菌性自噬”的假设。为证实该假设，本项目设计了下述研究内容。首先对AS体内外的抗菌活性及其上调组织/细胞自噬水平的效应进行了测定。在此基础上，分别围绕ROS-AMPK-SIRT1信号途径和Ca2+-CaMKKβ-FOXO1信号途径进行了相应的分子机制探讨。研究结果显示：①AS不具有直接抗菌活性，但可增强小鼠对细菌的清除能力，且该作用可能与其促进巨噬细胞内细菌的降解有关；②青蒿琥酯（AS）可上调小鼠组织和巨噬细胞的自噬水平，且该作用与其促进巨噬细胞杀菌活性密切相关；③青蒿琥酯（AS）通过上调NOX2的表达和活性，增加胞内ROS水平，进而活化AMPK-SIRT1通路，增强细胞自噬和杀菌活性；④青蒿琥酯（AS）对胞内钙离子水平无显著的增强作用，但细菌刺激可增加巨噬细胞胞外钙离子内流，升高胞内钙离子浓度，进而上调细胞自噬水平和胞内杀菌活性；⑤EC诱发的钙离子内流可激活CaMKKβ激酶活性，进而活化AMPK和ERK1/2信号通路，最终通过增加转录因子FOXO1的活性，上调自噬并增强细胞抗菌活性；⑥借助活性氧和自噬的研究手段，我们还对中心粒细胞杀菌机制——胞外诱捕网（NETs）的生成调控进行了扩展研究，发现血清剥夺可快速引发中性粒细胞ROS生成和自噬水平升高，进而诱导中心粒细胞的NETs和杀菌活性。上述研究结果表明，AS通过NOX2-ROS途径活化AMPK和SIRT1并上调巨噬细胞的自噬水平，是其增加细胞杀菌作用的主要分子机制。同时，细菌可单独引发巨噬细胞钙离子内流，进而活化CaMKKβ-AMPK/ERK1/2-FOXO1通路，是细胞应对细菌刺激的新防御机制。ROS和自噬的上调，还可以通过增强另一种胞内重要抗菌机制NETs的效应发挥杀菌作用。本项目研究发现一方面揭示了青蒿琥酯上调抗菌性自噬作用的分子机制，另一方面揭示了ROS、钙离子以及自噬的相互调节、共同在细胞抗菌作用中发挥重要调节作用的分子机制，为深化对天然免疫细胞抗菌机制的认识奠定了一定的理论和实验基础。