整合素α6β4/α3β1介导laminin α3基因涂层在种植体-牙龈生物学封闭形成中的作用及机制研究

A good biological sealing between the soft tissue and the implant could prevent oral bacteria and their products from penetrating the body and minimize the risk of peri-implantitis. Laminin332 is an important component of the internal basal lamina, and the junctional epithelial cells interact with the LG domain of the α3 chain of laminin332 via integrins α3β1 and α6β4, which is crucial for mediating cell behaviors and the formation of hemidesmosomes (HDs). However, the mechanism of laminin α3 mediating the integration of HDs in the formation of biological sealing between implant and gingival epithelium is rarely known. In this study, different models of gene transduction will be established to screen out the functioned domain of laminin α3, which is termed as LGn. Through the construction of the overexpression and interference adenovirus vectors immobilized on a multilayer coating on the titanium surface, the effect and mechanism of lamininα3 LGn mediating HDs in the formation of biological sealing between implant and gingival epithelium will be investigated. The study provide a new idea and experimental evidences for the research on the interface of implant and soft tissues.

Laminin332在种植体-牙龈生物学封闭形成中发挥重要作用，然而关于laminin332如何与整合素α6β4/α3β1相互作用促进种植体-牙龈结合界面半桥粒形成的具体机制尚不清楚。目前laminin332 α3 链羧基端LG区被认为是整合素α6β4 和α3β1 识别与结合的靶点，而且LG区对于保证laminin332 的生物活性以及促进半桥粒的形成及成熟都是必须的。基于整合素α6β4/α3β1介导laminin α3在半桥粒形成中的重要作用，本项目拟通过构建不同的基因转染模型，明确laminin α3在半桥粒形成中的功能区域LGn及其与整合素α6β4 /α3β1的作用机制；并通过在纯钛种植体表面原位基因转染体系的构建，进一步探讨LGn基因涂层在种植体-牙龈生物学封闭形成中的作用及机制。本课题为种植体周围上皮附着形成机制和改善种植体-牙龈生物学封闭方面的研究提供了新的思路以及实验依据。

种植体-牙龈上皮结合界面作为生物屏障在抵御病原体入侵中极为重要。与天然牙-结合上皮界面相似，种植体周围上皮主要依靠内基板和半桥粒附着在种植体表面。然而，种植体与牙龈的结合较为薄弱，上皮的附着仅局限在根方1/3。内基板中的重要组份为laminin 332，其中的α3链在细胞行为的调控以及半桥粒的形成中起重要作用。本研究通过构建载LAMA3以及各功能片段的腺病毒载体，利用体内、体外实验进行生物学评价，探讨其在种植体周围上皮附着形成中的作用及机制。. 本研究中首先利用层层自组装技术在纯钛表面制备由壳聚糖（CS）、透明质酸(HA)和IV型胶原(COL)组装的生物涂层。利用抗原-抗体的特异性结合将载LAMA3重组腺病毒固定在CS/(HA/COL)5涂层上，从而实现纯钛表面LAMA3基因原位转染体系的构建。通过体内实验，利用免疫组织形态学、透射电镜观察和辣根过氧化物酶（HRP）浸润性检测等研究纯钛表面载LAMA3涂层在种植体-牙龈生物学封闭形成中的作用。结果表明该涂层在创伤早期可以有效提高种植体周围上皮laminin α3的表达，加快种植体周围上皮的形成，促进种植体-牙龈结合界面半桥粒的整合，相比于光滑表面种植体组可以明显减少HRP在种植体周围牙龈组织中的浸润。. 本研究还构建了不同的过表达模型（Ad-LAMA3,Ad-LG1-5,Ad-LG1-3和Ad-LG45）,通过条件优化实验，表明MOI=200时细胞转染率可达50%以上，同时对细胞活性不会产生不良影响。通过蛋白水平的检测和透射电镜的形态学观察，结果相比于Ad-LG1-3、Ad-LG45的转染组，Ad-LAMA3、Ad-LG1-5在提高laminin a3以及半桥粒相关蛋白（plectin，bp180）的表达水平上表现较为明显。这提示我们，载入目的基因的完整性，对于相关蛋白在表达水平上的影响较大。. 此外，通过构建大鼠上颌第一磨牙颊侧结合上皮损伤模型，评价比较Saline组、Ad-GFP组、Ad-LAMA3组在结合上皮损伤后2d、7d、14d牙周再附着的情况以及结合上皮生物学封闭效果。体内实验结果表明，LAMA3过表达腺病毒可以有效提高结合上皮细胞内LAMA3和BP180的表达，同时促进牙齿-结合上皮界面半桥粒的表达，改善了结合上皮再附着后的生物学封闭效果。