玉米半胱氨酸蛋白酶See1在甘蔗花叶病毒侵染致病中的作用

Identification and characterization the function of host factors involved in viral infection is a key pathway to investigate viral pathogenicity and control virus. Our previous work identified a maize cysteine proteinase, See1, was significantly induced upon Sugarcane mosaic virus (SCMV) infection, and interstingly, See1 interacted with SCMV-encoded protein VPg in yeast. Plant cysteine proteinases play key roles in regulating bio- and abio-stress response, and senescencing, but their function in virus infection and pathogenicity remains unclear. In this study, a series of assays will be performed on SCMV-maize interaction system as following, (a) time-course analysis See1 accumulation during SCMV infection; (b) to identify the key domains and critical amnio acids invovled in the interactions between VPg and See1; (c) to test whether SCMV-encoding proteins, such as VPg, could incduce See1 expression; (d) to assay the effect of silenced and over-expressed See1 to SCMV infection and pathogenicity on maize; (5) combining all the data to dissect the possible function of See1 on SCMV infection and pathogenicity. This proposal focuses on one of the hot issues in modern viology research, and works on the important maize virus disease. The results will provide a clue to reveal the function of host proteins on pathogeniciy of SCMV and induction of dwarf mosaic symptom, and will produce novel idea to dissect the mechanism on the infection and pathogenicity of potyviruses.

阐明寄主因子在病毒侵染中的作用是研究病毒与寄主互作和解析病毒致病机制的重要途径。前期研究发现，甘蔗花叶病毒（SCMV）侵染玉米引起矮花叶病的过程中诱导了半胱氨酸蛋白酶See1的显著表达,初步鉴定了SCMV编码的VPg与See1互作。植物半胱氨酸蛋白酶是一类调控胁迫响应、衰老等过程的重要因子，但其在病毒侵染中的功能尚不清晰；鉴于此，本项目拟以SCMV-玉米为系统开展研究：①测定See1被SCMV侵染诱导表达的时间动态进程；②定位See1与VPg二者互作的关键结构域及氨基酸；③鉴定VPg等SCMV编码的蛋白是否单独诱导See1表达；④沉默和超表达See1对SCMV侵染致病的影响；⑤综合分析See1在SCMV致病中的作用。本项目围绕植物病毒病害研究热点，预期结果将为揭示寄主蛋白在SCMV侵染致病和症状形成中的作用机制提供数据，为综合解析SCMV等马铃薯Y病毒属成员的侵染致病机制提供新思路。

前期研究发现，甘蔗花叶病毒（SCMV）侵染玉米引起矮花叶病的过程中诱导了半胱氨酸蛋白酶See1的显著表达,初步鉴定了SCMV编码的VPg与See1互作。为阐明See1在SCMV侵染致病中的作用，根据项目研究计划和研究目标，首先通过酵母双杂交（Y2H）、GST pull-down、免疫共沉淀实验证明了SCMV VPg蛋白与ZmSee1成熟肽直接互作。ZmSee1基因转录在苗期的叶片中表达量最高，在叶鞘和根中的表达较少。对ZmSee1在SCMV侵染过程中的表达变化研究表明，在玉米品种Va35的接种叶中，SCMV侵染后第3天ZmSee1基因表达没有明显变化，但是PR1和PR5显著增加；在玉米自交系郑58的接种叶上，SCMV侵染24 hpi和72 hpi时ZmSee1成熟肽的表达有显著上调；而对玉米自交系昌7-2、黄早4、B73、Mo17、综31 ZmSee1的表达没有显著影响。利用荧光蛋白融合技术进行瞬时表达发现，ZmSee1:mRFP融合蛋白在烟草和玉米叶片细胞中均定位于细胞间隙，有少量定位于细胞质，在细胞核未观察到红色荧光。在SCMV系统侵染的玉米叶片中发现ZmSee1:mRFP的亚细胞定位与健康叶片中的定位相似，未观察到病毒对其亚细胞定位的影响。SCMV VPg:GFP在玉米和烟草叶片细胞中均定位于细胞核和细胞质。在烟草中共表达实验表明，VPg:GFP的表达不能改变ZmSee1:mRFP的亚细胞定位，不影响ZmSee1:mRFP的正常切割；初步研究表明，烟草叶片细胞中瞬时表达VPg对ZmSee1的半胱氨酸蛋白酶活性有抑制作用。利用BMV和CMV VIGS载体瞬时沉默ZmSee1基因，均使得SCMV的复制水平和蛋白积累有显著的增加。通过构建过表达和反向互补序列介导的RNAi转基因玉米株系，发现ZmSee1基因下调的植株中，幼苗期叶片较未转基因植株的叶片的宽度/长度的比率明显增加，接种SCMV第5天后系统侵染的第一片上部叶中，SCMV的复制量和CP积累量均显著上升，PR1和PR5显著增加。ZmSee1基因过表达的植株中，叶片的表型与野生型的相似，在SCMV侵染第5天后系统侵染的第一片上部叶中，SCMV CP的复制和积累量均受到抑制。