利用低氧诱导因子调控基因修饰BDNF表达的脑缺血损伤保护和干细胞增殖分化作用研究

利用低氧诱导因子HIF-1与低氧反应元件HRE结合，促进下游基因的转录和表达的特性，我们构建了以HRE作为缺氧靶向调节元件、携带BDNF基因的腺病毒质粒并用Hela细胞和小鼠脑缺血模型进行了初步研究。本项目将用其修饰人神经干细胞（hNSCs-5HRE-NT3），用免疫组化、Real-time PCR和Western blot技术，观察缺氧损伤对培养细胞BDNF表达的调控、对缺氧损伤神经干细胞的保护作用以及在神经干细胞增殖和分化能力的变化，特别是向功能神经元定向分化的作用；将hNSCs-5HRE-BDNF移植到大鼠脑缺血损伤部位，检测HIF-1的表达和缺血缺氧对BDNF表达的调节作用，用免疫电镜技术，观察对大鼠脑缺血的保护作用和神经元定向分化；并进一步研究HIF-1调控的基因修饰BDNF作用过程中的ERK/MAPK信号系统的作用。为脑缺血缺氧性损伤的可调控基因治疗研究提供理论基础和实验依据。

本项目用低氧反应元件HRE修饰人神经干细胞（hNSCs-5HRE-NT3），用免疫组化、Real-time PCR和Western blot技术，观察缺氧损伤对培养细胞BDNF表达的调控、对缺氧损伤神经干细胞的保护作用以及在神经干细胞增殖和分化能力的变化，特别是向功能神经元定向分化的作用；将hNSCs-5HRE-BDNF移植到大鼠脑缺血损伤部位，检测HIF-1的表达和缺血缺氧对BDNF表达的调节作用，用免疫电镜技术，观察对大鼠脑缺血的保护作用和神经元定向分化；并进一步研究HIF-1调控的基因修饰BDNF作用过程中的ERK/MAPK信号系统的作用。取得了如下的研究结果： 成功构建了含5HRE的重组逆转录病毒载体质粒pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP和逆转录病毒（RV-5HRE-NT3）；缺氧处理12 h后， PC12细胞内HIF-1α蛋白表达显著升高；在缺氧条件下PC12-5HRE-NT3中NT-3的mRNA和蛋白表达水平明显升高，缺氧条件下上清中NT-3含量升高了约9.6倍；而无5HRE调控的PC12-NT3中，缺氧条件下NT-3的mRNA和蛋白表达下降。另外，PC12-5HRE-NT3缺氧组的凋亡细胞百分明显减少，P-p38/p38比值和活化的caspase-3蛋白水平下调。在正常大鼠脑内未检测到HIF-1α表达，而tMCAO 1天后在位于缺血半暗带的胼胝体和纹状体中均有大量HIF-1α阳性细胞，在且第7和14天仍有HIF-1α表达。