深海新菌深渊藤黄单胞菌新型α-淀粉酶的温度适应性机制研究

α-amylase is one kind of broadly used industrial enzymes, most of which have been exploited from terrestrial organisms. However, marine α-amylase are largely unexploit. Luteimonas abyssi XH031 is a new identified marine bacteria which possesses good starch degrading ability. Genome sequencing analysis showed that LamA is a novel α-amylase. The highest sequence identity of LamA compared with well studied protein is only 22.5%. LamA possesses several speical characteristic features: calcium-depended high temperature resistance and sodium-depended highly catalytic efficiency under low temperature. Bioinformatic study indicated that LamA is a Ca-binding protein with a novel binding pattern. What is more, LamA contains Ca-Na-Ca binding site. In this project, the mechanism of Ca-related thermal tolerence of LamA will be studied. In order to clarify the sodium-depended catalytic mechanism under low temperature, the function of Ca-Na-Ca related amino acids will also be studied. Besides, we will also perform site-specific mutation assay to analyze the novel biochemical mechanism of LamA. Broadly thermal tolerance is important for amylase. This project will focues study on the mechanism of thermal tolerence of the novel marine α-amylase. Also, the result of this project will provide fundenmental research for exploiting more thermal tolerent and marine α-amylase.

α-淀粉酶是一种具有广泛用途的工业用酶，目前绝大多数来源于陆地生物，海洋来源的α-淀粉酶处于高度未开发状态。深渊藤黄单胞菌XH031是申请人所在实验室分离鉴定的一株具有很强淀粉降解能力的深海新菌。全基因组测序发现，LamA为新型α-淀粉酶，与已报道的蛋白质相似度最高仅为22.5%。前期研究表明，LamA为中温淀粉酶，具有新颖的宽温度耐受特征：钙离子依赖型耐高温特性及钠离子依赖型低温高活力。本课题拟研究离子相关的温度适应性机制，分析保守的Ca I结合区与缺失的Ca II结合区对LamA高温耐受性的影响；分析Ca-Na-Ca相关氨基酸对低温活性的作用，阐明钠相关低温高活力机制；通过活性位点氨基酸的置换，分析LamA的作用机制。能够适应宽温度范围的淀粉酶具重要应用价值，但具此特性的酶相对较少，本课题研究海洋新型淀粉酶的温度适应性机制，为开发具有宽温度适应性的淀粉酶提供理论基础。

【背景】从深海分离到一株具有很强淀粉酶活性的海洋新菌深渊藤黄单胞菌XH031（Luteimonas abyssi XH031），该菌的低温淀粉酶LamA具有新颖的宽温度适应性特征。研究显示其在低温环境下活力较高，同时，在离子条件下，高温时依然具有较好的活性和耐受性。这一特点具有很好的应用前景，开发宽温度适应性的淀粉酶，可以有效地简化许多工业流程，降低生产成本。【目的与研究内容】研究这一高活力酶的生理生化活性，进行生物信息学分析，研究其作用机制，明确与活力相关的关键氨基酸位点。分析钙离子依赖型的LamA高温耐受性，并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变，初步明确其作用机制。【结果】明确了该酶的温度耐受性，PH耐受性等活性指标，及对各种金属离子等条件的耐受能力。该酶基因全长1428bp，编码475个氨基酸。通过对LamA进行纯化和酶学性质研究后发现，其最适温度为50℃，最适pH为9，在pH 6.0-11.0的条件下仍能保持较高活性。在最适温度和pH下，酶活高达8881 U/mg，而且在10℃下，该酶仍能保持38%的活性，明显高于其他已报道的碱性淀粉酶。通过生物信息学寻找潜在的钙离子结合位点，利用分子生物学技术对目的氨基酸进行定点突变，表达纯化突变蛋白并进行功能鉴定。不同于其他几种金属离子，钙离子明显提高了LamA的高温耐受性：在未添加钙离子时，于65 ℃处理5分钟则失去90%活性；而在5 mmol/L钙离子条件下，于65 ℃处理半小时后仍具有36%的酶活。对预测位点进行定点突变后，突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活；N120D、Q185E和T224D活性降低，但在未添加钙离子时，突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大。在钙离子条件下，N120D的常温活性无明显降低，但65 ℃时的酶活仅为野生型的27.8%。通过分子生物学实验和蛋白结构模拟，我们推测，位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在高温下的结构。另外，我们正在对其进行上罐发酵尝试。【结论及科学意义】本研究初步明确了低温淀粉酶LamA具有钙离子依赖型耐高温机制，为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。