鸭坦布苏病毒TA125株致弱分子机制

Duck Tembusu virus (DTMUV) is a new pathogen that causes hemorrhagic ovaritis and a large decrease in egg production in laying ducks. We obtained an attenuated TA125 strain from a highly virulent wild-type TA strain by passage the virus over 125 times in cells; however, the molecular basis of this attenuation remains unknown. Compared with the highly virulent TA strain, the replication of TA125 in ducks was significantly decreased and TA125-infected ducks showed no signs of disease. Three chimeric viruses, in which the regions encoding the structural or nonstructural proteins of TA125 will be replaced with counterparts from the highly virulent TA strain, will be generated and evaluated for their pathogenicity and replication in ducks. Then, a series of chimeric viruses, in which the individual genes of TA125 will be replaced with counterparts from the TA strain, will be evaluated to identify the exact genes or regions of TA125 that are responsible for its attenuation. Finally, several chimeras containing these genes or regions of TA125 will be constructed on the TA backbone to confirm the identified genes or regions. This project will accurately document the genetic determinants of TA125 attenuation and provide data for elucidating the mechanism of TA125 attenuation in ducks.

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）病是以出血性卵巢炎和蛋鸭产蛋量大幅下降为主要特征的新发传染病。鸭接种完全致弱的弱毒株TA125后，无临床症状，体内复制能力与强毒株TA相比显著下降。目前对于DTMUV致弱的分子基础尚不清楚。本研究拟以TA125株为骨架，分别构建包含DTMUV 强度株TA株结构蛋白和非结构蛋白编码区的嵌合病毒，比较嵌合病毒与TA125株的生物学特性及动物体内复制能力，以明确TA125株致弱的关键区域；然后，构建一系列基于TA125株基因组、包含TA株各个蛋白基因的嵌合病毒，检测各嵌合病毒的生物学特性及动物体内复制能力，从而确定TA125株致弱的关键基因；最后，构建以TA株为骨架、包含TA125株关键基因或区域的嵌合病毒，动物试验验证TA125致弱的重要基因（区域）。本项目可望精确定位DTMUV致弱的关键基因（区域）。

本相研究从两个方面探讨坦布苏的致病相关位点机理。1.免疫学方面：黄病毒诱导产生型特异性和交叉反应性两种抗体。交叉反应性中和抗体不仅使得血清学诊断无法识别被感染的病毒，更为重要的是可通过抗体依赖性增强（Ab-dependent enhancement，ADE）导致更严重的感染性和致病力。对坦布苏E蛋白与其单克隆抗体的免疫反应性研究，确定了三个黄病毒交叉反应性抗原表位221LD/NLPW225，227GSSAGTWQN235和374EXE/DPPFG380以及一个DTMUV 特异性抗原表位87YAEYI91。而231G或233W突变，使得交叉中和表位227GSSAGTWQN235完全失去了与DTMUV、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）和寨卡病毒（ZIKV）阳性血清的反应性，具有潜在的增强黄病毒的感染性和致病力。因此231G或233W的确定对黄病毒的血清学交叉反应的认知和对抗体依赖性增强（ADE）导致更严重的病毒继发感染和致病力增强的理解具有重要意义。2.强、弱毒基因组差异：TA和TA125基因组有4个氨基酸差异，均在E蛋白上（E297，E306，E367和E409）。模拟分析确定E306R/E367K位于病毒粒子表面，与细胞受体结合的几率大，且E306R/E367K碱性氨基酸均带有正电荷可能与TA125致弱相关。实验证明E306R和E367K碱性化所带正电荷增强了heparin（GAG）抑制DTMUV结合敏感性，限制了DTMUV在小鼠脑内的扩散。本研究证明了E蛋白是DTMUV致弱或致病有关的关键基因，而E306R/E367K在病毒的毒力减弱方面起重要作用。目前已发表13篇研究论文，其中9篇SCI文章，4篇中文核心期刊，申请国家发明专利3项，培养研究生1名。