孔道形成蛋白调控细胞外囊泡分泌的功能和机制

Extracellular vesicles play a vital role in cell communication and survival adaption, bacterial pore-forming toxin Aerolysin-like proteins (ALPs) widely distribute in plants and animals. In our previous study, we identified a new ALP complex βγ-CAT from amphibian, and found that this protein can promote the generation of cell vesicles (PNAS, 2014, cover story；J Infect Dis，2017). But the function of secretion of extracellular vesicles regulaed by βγ-CAT is unknown. Based on this, this project will study the size and type of extracellular vesicles stimulated by βγ-CAT;determine contents (proteins,nucleic acid and lipids ) in extracellular vesicles ; uncover its biological function;explore the mechanism of secretion of extracellular vesicles. This study will provide new scientific evidence and idea about the mechanism and biology significances of secretion of extracellular vesicles.

细胞外囊泡在细胞交流及生存适应中发挥重要的作用，细菌孔道形成毒素Aerolysin类似蛋白（ALPs）广泛存在于动植物中。我们前期从两栖动物中分离到新型ALP类孔道形成蛋白复合物βγ-CAT，并发现其具有促进细胞囊泡生成的作用（PNAS，2014，封面文章；J Infect Dis，2017）。但其在调控和促进细胞外囊泡分泌产生中的功能未知。在此基础上，本项目将深入研究βγ-CAT促进细胞产生的细胞外囊泡的主要类型及大小；确定βγ-CAT刺激生成的细胞外囊泡中的内容物，包括蛋白质，脂类及核酸物质类型；揭示所产生的细胞外囊泡的生物学活性；探究βγ-CAT促进和参与细胞外囊泡产生的分子机制。项目的研究结果将为促进细胞外囊泡产生的具体机制及生物学意义提供新的科学依据及科学思路。

细胞外囊泡是由细胞产生的包裹众多生物活性分子的脂质双层封闭结构，在细胞间通讯、细免疫反应、神经退行性疾病和肿瘤等生理病理事件中发挥重要作用。目前，大量的报道集中于胞外囊泡的内容物与功能利用，而关于细胞外囊泡的生理调控元件及发生机制研究的较少。孔道形成蛋白是一类依赖细胞膜发挥作用的大分子物质，广泛分布于各界生物中。该类蛋白在人造生物膜结构如脂质体或者细胞膜上形成性质不一的孔道，介导膜内外的物质交流，进而诱导不同的生物学功能。而孔道形成蛋白与胞外囊泡之间的相互关系目前还未报道。我们前期以两栖动物大蹼铃蟾（Bombina maxima）为研究模型，从其皮肤分泌物中分离得到在孔道形成蛋白和三叶因子复合物βγ-CAT，并初步揭示该蛋白在内吞溶酶体上形成孔道，介导内囊泡的离子流交换，进而激活天然免疫及清除胞内病原菌(PNAS, 2014，封面故事；J Infect Dis，2017)。本研究主要开展以下4项研究内容（1）βγ-CAT与胞外囊泡之间的作用（2）细胞外囊泡内容物的差异（3）细胞外囊泡的生物学活性（4）细胞外囊泡的产生机制。.项目按计划执行，进展顺利。首先，在多种细胞株上发现βγ-CAT刺激胞外囊泡的产生，这些细胞株包括小鼠免疫树突细胞、大蹼铃蟾原代细胞及其成纤维细胞系等。我们还发现βγ-CAT直接作用于游离的细胞外囊泡，在胞外囊泡上形成孔道并释放其内容物，如代谢小分子。以大蹼铃蟾为研究模型探究胞外囊泡在两栖类水平衡维持的功能，表明βγ-CAT促进大蹼铃蟾尿道上皮细胞和犬肾细胞释放胞外囊泡，并且这些胞外囊泡特异性的携带了胞外物质，比如水通道蛋白等；进而促进水通道的重排而维持机体的水平衡。除此外，我们在大蹼铃蟾饥饿模型中探究了胞外囊泡与营养输送之间的关系，揭示了βγ-CAT特异性的促进携带营养物质的胞外囊泡释放，并被饥饿的成肌细胞摄取以支持其生存。关于βγ-CAT促进胞外囊泡产生的机制研究，我们发现βγ-CAT促进细胞胞饮并且在细胞多泡体具有很好的共定位，即胞外囊泡发生的亚细胞器，提示βγ-CAT可能通过改变细胞内的多泡体进而促进胞外囊泡的产生。.目前已发表标注该基金资助SCI期刊论文9篇，发表于Commun Biol， FASEB J, The Journal of Immunology, J Biol Chem, Allergology Internation。