鸭坦布苏病毒入侵血-脑屏障的细胞分子机制

As a pathogen of major livestock and poultry disease,which was firstly found in China,Duck Tembusu virus (DTMUV) infects ducks with temporal sequence.After the implementation of dynamic analysis on DTMUV breakthrough the blood-spleen barrier (BSB) by our group,the infection mechanism of DTMUV is further revealed from the new perspective of blood-brain barrier (BBB) in this project.The cellular pathological changes of infected duck brain and its BBB are observed by using morphological techniques.The virus distribution in brain is showed by immunofluorescence reaction. The expression dynamics of endothelium Annexin-II (A2),VE-cadherin,and various tight-junction proteins is detected.The inherent laws are uncovered,concerning the vascular junction complex injury and permeability transition of duck BBB.The interaction of A2,VE-cadherin,and various tight-junction proteins is further studied by using immunoprecipitation,laser confocal microscopy,and immune colloidal gold techniques in vivo and in vitro.The Molecular mechanism on down-regulation of A2 to VE-cadherin,and its decrease to the reassemble of tight-junction proteins is closely investigated. At the same time,A2 regulation to BBB junction complex is verified in vivo by recombination A2 injection through duck pterygoid vein.Together with the last discovery,our results will systematically elucidate the pathological mechanism of DTMUV disease,and theoretically support the prevention and virous vaccine development of the disease.

作为首发于我国的重大畜禽疫病病原，鸭坦布苏病毒（DTMUV）的感染过程具有明显时序性。在揭示了DTMUV突破血-脾屏障（BSB）机理的基础上，课题组将从血-脑屏障（BBB）的新角度继续探究该病毒的致病机制。应用形态技术分析DTMUV引发BBB结构变化的细胞学特征，显示病毒在脑组织的分布定位，厘清内皮膜联蛋白A2、钙黏蛋白与各种紧密连接蛋白的表达动态，阐释感染鸭BBB血管连接复合体损伤与屏障通透性改变的内在规律。进一步应用免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫胶体金技术，深入研究DTMUV感染期A2、钙黏蛋白以及连接相关蛋白的互作关系，解析病毒下调A2表达、降低钙黏蛋白动员与紧密连接蛋白再组装的分子机理。同时，静脉注射外源重组A2，验证DTMUV入侵对BBB屏障作用的影响机制。研究结果将与上个项目的实验发现一起，完整、系统地阐明DTMUV的致病机理，为DTMUV病的防治与疫苗开发提供有效的理论支撑。

鸭坦布苏病毒（DTMUV）的感染过程具有明显时序性，血-脑屏障（BBB）是病毒入侵中枢神经系统的关键。本项目从BBB发育结构与功能关系的新角度开始探究该病毒的致病机制。通过透射电镜和免疫组织化学方法对胚胎期和胚后期鸭BBB结构进行观察发现，鸭BBB形成是一个渐进的过程，其结构在胚胎期变化显著，DTMUV感染能够引起鸭非化脓性脑炎，尤其是雏鸭。与雏鸭相比，成年鸭感染DTMUV后脑损伤并不严重。应用形态学和分子生物学技术，分析攻毒后雏鸭和成年鸭BBB结构变化的细胞学特征和病毒在脑组织的分布定位，阐释了BBB发育水平的不同是导致雏鸭发生严重脑炎的因素之一。利用Transwell小室构建体外BBB模型，研究DTMUV在脑微血管内皮细胞中的感染动力学和其对BBB渗透性的影响，并通过RNA-seq测序技术筛选与血脑屏障破坏和非化脓性脑炎发生相关的关键因子进行验证，分析感染鸭BBB血管连接复合体损伤与屏障通透性改变的内在规律。DTMUV感染早期，BBB完整，但脑内已经可以检测到病毒粒子，DTMUV在血-脑屏障发生破坏之前已经进入脑内。DTMUV进入中枢神经系统引起以BBB损伤为特征的非化脓性脑炎，炎症反应在BBB破坏过程中起重要作用。炎症因子的大量积累不仅会损害BBB的完整性，还会促进外周免疫细胞向中枢神经系统募集。研究发现DTMUV可以直接感染鸭脑微血管内皮细胞并从基底外侧释放到脑实质中，同时感染淋巴细胞并可促进脑微血管内皮细胞与淋巴细胞的粘附。综上所述，DTMUV进入脑内后引发的“炎症因子风暴”是BBB破坏的主要原因，其可能是通过跨细胞和“特洛伊木马”方式跨BBB并入侵中枢神经系统。在完成计划任务的同时，我们进一步开展了DTMUV诱导脑内凋亡发生、重组表达膜联蛋白A2和鸭脑原代神经元分离培养和鉴定等方面的研究并取得了一定成果。上述研究结果从结构到功能系统、完整地阐明DTMUV的致病机理，为DTMUV病的防治与疫苗开发提供有效的理论支撑。