新发鸭坦布苏病毒分子致病机制研究

2010年上半年以来，一种新兴病毒引起的以鸭死亡和蛋鸭产蛋下降为特征的新发传染病，导致我国养鸭业遭受了巨大经济损失。申请人带领的研究团队率先分离鉴定出引起这一传染病的病原- - 黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的坦布苏（Tembusu）病毒。坦布苏病毒最早是从库蚊和伊蚊体中分离到的，之前，该病毒很少引起人或动物的传染病，也从未有鸭子感染的报道，因此没有引起研究人员的足够重视，到目前为止，该病毒的分子致病机制还是一片空白，这对该病的防控非常不利。为此本项目拟在前期研究基础上，对致病力不同的毒株进行全序列分析、筛选可能与致病力相关的基因或氨基酸位的；建立不同致病力病毒株的反向遗传操作系统、利用定点突变和部分基因替换等方法人工突变病毒；通过比较病毒突变株对麻鸭的致病力，确定与新兴鸭坦布苏病毒致病力相关的基因和位点，阐明坦布苏病毒对鸭致病力变化的分子规律。

本研究成功培育了鸭坦布苏病毒弱毒株（FX2010-180P株），通过比较鸭坦布苏病毒(DTMUV)奉贤分离株（FX2010株）和弱毒株FX2010-180P株序列比对，发现强弱病毒有19个氨基酸突变位点不同，分别为：M蛋白有1个突变点（A106V），E蛋白有8个突变点（D37N，E89G，D120N，Y155F，A157V，R166K，V312A和M349K），NS1有3个突变点（R192G，K205R和V262A），NS3有1个突变点（T322I），NS4A有2个突变点（F54L，V110A），NS4B有2个突变点（F50Y，S112L），NS5有2个点突变（R273G，V793A）。其中，有8个氨基酸突变点位于与病毒毒力密切相关的E蛋白上，这些突变可能是导致鸭坦布苏病毒毒力减弱的关键因素。. 成功构建了鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒株反向遗传操作系统，利用该系统成功拯救了鸭坦布苏病毒强毒株（rFX2010）、弱毒株FX2010-180P（rFX2010-180P）及弱毒株E基因替换强毒株E基因的重组病毒（R-FX2010-180E）。研究表明FX2010、R-FX2010可以引起鸭全身性感染，病毒可通过鸭之间的直接接触来传播，而FX2010-180P、rFX2010-180P感染能力弱，不能通过接触传播，R-FX2010-180E对鸭的感染能力明显减弱，且不能够通过接触传播，表明E蛋白的替换使得强毒致病力显著降低，E蛋白的8个氨基酸位点（D37N，E89G，D120N，Y155F，A157V，R166K，V312A和M349K）突变与病毒致病力密切相关，该结果初步阐明了鸭坦布苏病毒FX2010致弱的分子机制。. 为研究DTMUV对哺乳动物的致病性，以BABL/c小鼠为实验动物模型，以FX2010为代表株，首先通过脑内直接感染方式传25代、然后鼻腔感染继续传代至28代。通过比较FX2010、P7、P14、P21和P28毒株对小鼠的致病性和全基因组序列发现，FX2010鼻腔攻毒不感染小鼠，从P7病毒开始能够通过鼻腔感染致死小鼠。从FX2010到P28，核苷酸位点突变12个，病毒基因组氨基酸位点突变只有6个，FX2010与P7之间只有两个氨基酸位点突变（E597K和A2001T），表明E597K和A2001T在DTMUV对小鼠致病性增强中起到了关键作用。