伯氏疟原虫ANKA株诱导脑型疟发生的基因定位及功能验证

Cerebral malaria is the leading cause of death in patients with severe malaria. The research of cerebral malaria revealed that lymphocyte infiltration of the brain consisting mainly of CD8+ T cells is the main effector mechanism of experimental cerebral malaria. And latest research shows that the effects of CD8+ T in the brain are mainly regulated by parasite, but its components are unclear. Although the Plasmodium berghei genome sequencing has been completed, gene knockout method is difficult to identify the primary components of Plasmodium berghei,which induced cerebral malaria, due to many gaps in genome. Genetic hybrid technology is a powerful tool for identification of Plasmodium-related phenotype, and our previous work confirmed that P.b ANKA infection can induce experimental cerebral malaria occurs, but P.b NK65 will not.Therefore,this project intends to perform genetic cross using ANKA and NK65 parasites,cloning and screening recombinant progeny from the cross,genetic linkage analysis of cerebral malaria phenotype of each recombinant progeny，identify genetic locus/loci and candidate genes that correlated with cerebral malaria.Then using gene knockout to evaluate the function of candidate genes.This is a new perspective of understanding the immunopathogenesis of cerebral malaria, and may provide new targets and ideas for the prevention and treatment of cerebral malaria.

脑型疟的发生是重症疟疾患者死亡的主要原因。研究证实，脑部以CD8+ T细胞为主的淋巴细胞的浸润是脑型疟发生最主要的效应机制，而最新的研究表明，疟原虫是调节CD8+ T细胞在脑部发挥效应的关键，但尚不清楚其成分。虽然伯氏疟原虫基因组测序工作已经完成，但由于序列的缺口较多致使采用基因敲除等方法很难鉴定伯氏疟原虫诱导脑型疟发生的关键成分。遗传杂交技术是鉴定疟原虫相关表型的有力工具，且我们前期工作证实P.b ANKA感染可诱导实验脑型疟发生，而P.b NK65则不会。因此，本项目拟通过构建P.b ANKA×P.b NK65杂交体系，从杂交组中克隆并筛选重组子代，遗传连锁分析各重组子代脑型疟发生的表型，定位出控制脑型疟发生的基因座位并鉴定候选基因，然后采用基因敲除技术对候选基因进行功能验证。这是从新的角度探讨脑型疟的免疫病理机制，并可为脑型疟的防治提供新的靶点和思路。

脑型疟的发生是重症疟疾患者死亡的主要原因。研究证实，脑部以CD8+ T细胞为主的淋巴细胞的浸润是脑型疟发生最主要的效应机制，而疟原虫是调节CD8+ T细胞在脑部发挥效应的关键，但尚不清楚其毒力成分。本项目拟通过构建P.b ANKA×P.b NK65杂交体系，从杂交组中克隆并筛选重组子代，遗传连锁分析各重组子代脑型疟发生的表型，定位出控制脑型疟发生的基因座位并鉴定候选基因，然后采用基因敲除技术对候选基因进行功能验证。项目遗传杂交工作已全部完成，共获得杂交子代89个，QTL连锁分析将毒力相关基因座位定位到P.berghei 13号和10号染色体上，进一步精细分析发现两条染色体上共56个contigs及122个预测基因，应用生物信息学分析，我们挑选了编码Rhoptry protein (ROP)的基因（裂殖体时期入侵相关）进行功能验证，目前敲除工作已完成，正在进行功能验证实验。此外，鉴于疟原虫感染造成宿主过强的免疫反应是实验脑型疟发生的重要原因，而TLR受体在抗感染免疫中发挥重要作用，我们对TLR2和TLR4受体在脑型疟中的作用进行了研究。我们利用P.b ANKA感染TLR2、TLR4缺失的C57BL/6小鼠，结果发现无论是模拟自然感染的蚊叮实验，还是子孢子与红内期原虫感染实验，TLR2和TLR4敲除小鼠在原虫率、实验脑型疟发生率和存活率上与WT小鼠无显著差异，证实实验脑型疟的发生不依赖于TLR2和TLR4的参与。再者，我们对疟原虫基因敲除技术进行了改进。原虫基因敲除技术是鉴定预测基因功能的重要工具。前期我们已经成功建立了疟原虫基因敲除技术平台，但传统方法中的裂殖体培养周期长，效率低，很难满足短期内大量的敲除工作，为此我们对传统方法进行了改进，结果显著提高了敲除实验效率并缩短了实验时间，我们对这项技术改进申请了一项国家发明专利并获得了授权。最后，我们还构建了新的实验脑型疟动物模型。虽然目前实验脑型疟动物模型多采用P.b ANKA感染近交系小鼠，但远交系小鼠已被证实在鉴定影响宿主易感或抵抗疾病的关键因子中具有特定的应用优势，在药物和疫苗研究中也具有广泛的应用前景。我们利用国内特有的远交系昆明小鼠，经过大量实验摸索，成功构建实验脑型疟远交系小鼠模型。此模型的建立可为后续遗传连锁分析其他影响宿主易感或抵抗疟原虫感染的基因提供有力支持。