基于适配子的SPR生物传感体系的构建及其在肿瘤标志物分析中的应用

发展高选择性、高灵敏度、快速准确的肿瘤标志物分析方法对于癌症早期诊断具有重要的方法学意义和应用价值。本项目拟以几种典型肿瘤标志物的适配子作为识别元件，构建免标记、高灵敏的表面等离子体共振(SPR)肿瘤标志物传感体系，研究其识别性能及作用机理，发展基于适配子的快速、灵敏、准确的肿瘤标志物分析检测新方法。将此新方法应用于癌症患者血清中超微量肿瘤标志物的分析检测，拓展该方法在癌症早期诊断中的应用。本项目将适配子的廉价易得、高特异性、高亲和力的优点与SPR技术的实时、在线、免标记、高灵敏的特性相结合，发展基于适配子的SPR肿瘤标志物分析检测新方法，避免了传统方法步骤繁琐、使用昂贵抗体及需要标记的不足。该项目的研究成果将为推动适配子在新型传感体系的构建、其他疾病标志物的分析检测、基于分子靶点的药物开发、疾病诊断及临床治疗等领域中的应用提供理论与实验基础。

本项目以适配子/寡核苷酸作为识别元件，构建了一系列石英晶体微天平(QCM)生物传感平台，研究识别性能及作用机理，发展了与肿瘤及其他重大疾病密切相关的目标分子的实时在线、免标记、高灵敏、高选择性的分析检测新方法。主要进展如下：1) 金纳米粒子增强的QCM-D核酸适体生物传感体系的构建及其在蛋白质分析中的应用。选择与凝血相关的多种重大疾病的潜在标志物凝血酶为模型化合物，构建了基于适配子和金纳米粒子信号增强的QCM凝血酶生物传感器。凝血酶的检测限可达0.1 nmol/L，线性范围为0.5–12.5 nmol/L。2) 基于Toehold链置换反应构建QCM生物传感器及其在SNPs分析中的应用。选择p53肿瘤抑制基因的序列片段作为检测对象，发展了基于Toehold引导的链置换反应构建“捕获探针-目标序列-报告探针”信号增强型QCM传感体系的新方法。目标序列与不同类型单碱基突变序列所产生信号的区分因子大于20，最高可达63。该传感体系对目标p53肿瘤抑制基因的序列片段的线性响应范围为0.2–20 nmol/L，检测限为0.2 nmol/L。3) 基于自组装DNA纳米结构搭建增强型QCM-D生物传感平台及核酸检测。发展了以寡核苷酸为原材料，在线构建超级三明治结构实现QCM-D信号放大的新方法。在QCM-D平台上实现了以寡核苷酸为原材料的在线放大。该体系对目标DNA的线性响应范围为0.5–25 nmol/L，检测限为0.1 nmol/L。HeLa细胞裂解液加标回收率可达85%。同时，体系还对单碱基突变序列实现了非常好的区分。4) 可再生型QCM生物传感器的构建及其特异性检测突变型MTHFR C677T。选择与神经管缺陷（第二大先天性疾病）、冠心病等疾病相关的突变型MTHFR C677T基因序列片段作为检测对象，构建了基于链置换反应的再生型QCM生物传感体系。该传感体系具有良好的再生性，循环5次后仍保留87%的响应信号。发展的方法避免了传统方法步骤繁琐、使用昂贵抗体及需要标记的不足，具有简单快速、实时在线、免标记、高灵敏、高选择性的优势。实际样品加标回收分析的初步研究表明，这些新型QCM-D生物传感平台有望应用于生物样品中肿瘤标志物和重大疾病相关的特定核酸序列的分析检测。