隐孢子虫入侵介导的宿主细胞自噬相关分子鉴定及功能研究

Cryptosporidiosis caused by Cryptosporidium spp. has been considered as a zoonotic disease with public health significance in the world. Accumulating evidence supports the pivotal role of autophagy in host defense against intracellular pathogens based on its homeostatic mechanism. However, it is still unclear about the effect of autophagy in C. parvum infection and which kind of autophagy related genes (Atg) main take part in such invasion process. This project propose to focus on Cryptosporidium invasion to host cell. Together with qRT-PCR ⊿⊿CT calculate method of sporozoite invasion rate, transmission electron microscope and subcellular localization technology will be used to observe the autophagosome formation and location, in order to comprehensively analyze the effect of cell autophagy in C. parvum infection. Then we will identify the major autophagy related molecule according to analyze the expression of Atg5, Atg7, Atg8 and Atg12 in transcription and translation level, and functionally verify such target Atg proteins through RNA-mediated gene silencing, over expression. Therefore, target Atg proteins which play a critical role in autophagy could be identified and its interplay between host cell autophagy and C. parvum infection will be clarified. These findings may provide strong data support for seeking possible regulatory pathways with its interacting receptor protein of C. parvum in future.

隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的一种重要人畜共患寄生虫病。研究认为自噬是细胞维持稳态的一种机制，在细胞与病原体相互作用的过程中发挥着重要作用。但目前尚无宿主细胞自噬与隐孢子虫感染之间的相互作用，以及哪些自噬分子与虫体入侵介导相关的研究报道。本申请项目拟围绕隐孢子虫入侵宿主细胞这一环节，应用透射电镜、亚细胞共定位技术研究宿主细胞自噬小体的形成及分布，建立子孢子入侵率计算方法（qRT-PCR⊿⊿CT），综合分析自噬水平上调、下调对隐孢子虫感染的影响。进而通过解析隐孢子虫入侵后Atg5、Atg7、Atg8、Atg12等自噬相关分子在转录和翻译水平上的表达差异来鉴定虫体入侵介导的自噬关键作用分子，并利用细胞转染、RNAi技术构建靶Atg分子过表达和缺失突变株研究其在入侵过程中的生物学功能。预期成果将阐明与隐孢子虫入侵介导相关的自噬关键作用分子，为下一步寻找与之互作的隐孢子虫受体蛋白奠定基础。

隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的以腹泻为主要特征的重要寄生虫病，具有重要的公共卫生意义。目前，尚无对该病有效的防治手段，对隐孢子虫与宿主细胞的相互作用及其入侵机制尚不清楚，成为抗隐孢子虫药物和疫苗研制的“瓶颈”之一。自噬是细胞维持稳态的一种机制，在细胞与病原体相互作用的过程中发挥着重要作用。本项目利用微小隐孢子虫HCT-8细胞培养模型，探讨了虫体感染对宿主细胞自噬之间的相互作用机制，取得了如下成果：（1）明确了C. parvum在HCT-8上的发育特性，获得了虫体标记抗体，优化了隐孢子虫HCT-8宿主细胞体外培养模型，掌握虫体入侵、发育的各个时间节点；（2）分别从免疫荧光（IF）、免疫印迹（WB）和透射电镜（TEM）几个方面的实验数据证明了微小隐孢子虫感染可激发宿主细胞HCT-8自噬的产生；（3）分别选取自噬诱导剂Rapamycin、EBSS、抑制剂3-Methyladenine对HCT-8细胞进行药物处理，建立并优化诱导体系；（4）用等量的隐孢子虫卵囊分别入侵上述不同药物处理组细胞，参照Cai等建立的虫体入侵评价方法计算Cp对不同处理组细胞的入侵率差异。结果表明，隐孢子虫对自噬诱导组的入侵率低于自噬抑制组，在一定程度上证明了宿主细胞自噬程度增加对于隐孢子虫的入侵具有一定的抵制作用。（5）通过对隐孢子虫感染后自噬关键分子的筛选，发现Atg5，Atg12在转录水平上表现出差异性。继而对自噬关键分子Atg5和Atg12进行功能验证，经虫体感染实验发现Atg5下调组细胞的入侵率高于正常组细胞，Atg12上调组细胞的入侵率低于正常组细胞，进一步说明自噬通路在隐孢子虫入侵过程中具有重要作用。项目研究成果将为进一步深化隐孢子虫感染引起的宿主细胞自噬作用通路、信号转导机制研究以及探寻新的防控方法提供了重要的理论依据。