基于NKp44+NK细胞类风湿关节炎发病机制及乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白对其干预的研究

类风湿关节炎（RA）是一种病因病机未明的自身免疫性疾病，既往研究显示天然免疫在其发病中起重要作用。NK细胞是天然免疫系统重要组成部分，新近研究发现NKp44+NK细胞通过分泌IL-22在炎性肠病中发挥致病效应。申请者前期研究发现：RA患者滑液中NKp44+NK细胞比例较外周血及健康对照明显升高，NKp44+NK细胞体外能分泌高浓度IL-22且可促进CD4+T细胞向Th17分化。在此基础上，本项目拟：①从RA患者中分离NKp44+NK细胞并对其进行功能分析②建立NKp44+NK细胞与CD4+T细胞共培育体系，明确其促进Th17细胞分化的作用和机制③构建IL-22-/- C57BL/6小鼠CIA模型，研究NKp44+NK的炎症作用和机制④利用治疗RA中药乌梢蛇，探索其对NKp44+NK细胞的干预作用。研究目标是：阐明NKp44+NK细胞在RA发病中的作用和机制，为RA治疗提供新的思路和靶标。

本研究以探索NKp44+NK细胞在类风湿关节炎（RA）发病中的作用和机制，以及中药乌梢蛇对其干预机制为主要目的。课题集中从以下及方面进行了深入研究：从RA患者分离NKp44+NK细胞以及其亚群NK-22细胞并对其进行了功能分析；对RA成纤维样滑膜细胞（FLS）进行体外培养与鉴定，并研究NKp44+NK细胞促RA-FLS增殖的分子和信号通路机制；研究Treg/Thl7在类风湿关节炎中的失衡表达及调节机制；通过构建小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型，研究了乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白的提取及其对CIA小鼠Treg/Th17细胞平衡的影响。研究取得如下成果：1.NKp44+NK细胞不仅在RA患者外周血和滑液中高表达，同时其亦在患者滑膜组织中表达，且高表达的NKp44+NK细胞与患者临床疾病活动度呈正相关；2.NKp44+NK细胞体外培养能够分泌IL-22、M-CSF和RANKL，特别是能够分泌高浓度的IL-22，其所分泌的IL-22是促进RA-FLS增殖的重要细胞因子；3.NKp44+NK细胞所分泌的IL-22促进RA-FLS增殖是通过活化STAT3信号通路实现的；4.RA患者关节液NK-22细胞可明显刺激FLS增殖,其可能机制与NK-22细胞能分泌IL-22、TNF-α有关。5.CIA 大鼠关节滑膜存在Treg/Th17分化失衡；TNFR-Fc可能通过抑制关节滑膜Th17细胞分化，诱导Treg细胞生成/聚集，使得病变关节的Treg/Th17平衡得以恢复。6.提取、鉴定了乌梢蛇II型胶原蛋白（ZCⅡ）,对ZCⅡ进行了质谱分析，发现与其他物种的CⅡ具有较高的同源性；7.从关节炎临床表现及组织病理学两方面证实，ZCⅡ能够显著改善CIA小鼠的关节炎症；ZCⅡ可能通过调节脾脏、肠系膜淋巴结及关节滑膜组织中Treg/Th17比率及其细胞因子的水平，重新诱导CIA小鼠的免疫平衡，缓解关节炎症。总体上，研究阐明了NKp44+NK细胞在RA发病中部分作用机制，以及乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠Treg/Th17平衡的影响，为RA的治疗提供了新的思路和靶标。