细胞色素P450 CYP4G199在粘虫表皮发育中的功能及其转录调控研究

Cytochrome P450s participate in cuticular hydrocarbon (CHC) biosynthesis, affecting cuticle development in insects. However, the actions of P450s in CHC biosynthesis are not entirely clear, and the transcriptional regulation of these P450s remains unknown. Our previous studies showed that CYP4G199 specifically and highly expressed in the cuticle of an agricultural pest Mythimna separata. In this study, we will analyze the distribution of CYP4G199 in M. separata using RT-qPCR and immunofluorescence. Functions of CYP4G199 in cuticle development and CHC biosynthesis will be investigated using RNAi. With the eukaryotic expression system, we plan to obtain the recombinant protein of CYP4G199 and identify its role in catalyzing CHC production. The transcriptional regulation of CYP4G199 will be determined using the luciferase reporter assay. The results will clarify the function and mechanism of CYP4G199 in cuticle development and determine the transcriptional regulation of CYP4G199 in M. separata. The findings will provide a novel strategy and a potential target for pest control.

细胞色素P450参与昆虫表皮碳氢化合物合成，影响昆虫表皮发育，而P450催化表皮碳氢化合物合成的途径尚不完善，该类P450基因的转录调控机制尚属未知。针对重要农业害虫粘虫，课题组前期研究发现P450基因CYP4G199在粘虫表皮特异性高表达，据此，本项目拟1）通过免疫荧光技术确定CYP4G199蛋白在粘虫表皮细胞的分布，利用RNAi沉默CYP4G199，探明该基因在昆虫表皮发育和表皮碳氢化合物合成中的功能；2）通过体外表达CYP4G199蛋白，代谢不同底物如醛类物质，解析其在表皮碳氢化合物合成中的催化作用；3）通过荧光素酶检测系统确定CYP4G199基因的调控元件和转录因子，明确其转录调控方式。研究结果将揭示CYP4G199在粘虫表皮发育中的功能和机理，明确该基因的转录调控机制，为探索粘虫的绿色防治方法和寻找潜在防治靶标提供理论依据。

东方粘虫Mythimna separata（Walker）是我国重要农作物害虫，对农作物造成巨大的损失，随着其抗药性日益增强，开发绿色新型杀虫剂靶标显得尤为重要。本项目基于东方粘虫幼虫表皮转录组测序，鉴定出在表皮中特异高表达的P450基因CYP4G199，通过RT-qPCR明确了该基因在幼虫显著高表达，在4龄幼虫表皮表达水平高于其余时期的表皮。在3到4龄幼虫蜕皮过程中，CYP4G199在蜕皮6 h表达水平显著低于其余时期。通过RNAi技术可显著降低CYP4G199表达水平，达到50%，并导致幼虫表皮出现缺刻，部分表皮为透明色。CYP4G199沉默后幼虫表皮碳氢化合物中十六烷烃、二十八烷烃的含量降低。通过真核表达发现，CYP4G199可将十七烷醛代谢为十六烷烃，具有氧化脱羰基活性。基于基因组数据，CYP4G199有11个外显子，10个内含子，在-1062到+24之间可能存在转录因子结合位点。构建CYP4G199缺失启动子的重组质粒，使用双荧光素酶报告系统检测启动子活性，发现在-498至-292之间可能存在沉默子，在-888至-498之间可能存在增强子。使用不同生物软件预测出CYP4G199启动子区域主要含Hb、Ftz和En三个结合位点。利用RT-qPCR明确了FTZ-F1在东方粘虫的时空表达，沉默FTZ-F1后，CYP4G199的表达量显著下调了50%，注射dsFTZ-F1的幼虫出现表皮残缺，颜色浅淡，表型与沉默CYPG4199基因后出现的表皮残缺情况类似。因此，本项目明确了CYP4G199参与东方粘虫表皮的形成与机制，转录因子FTZ-F1可能参与CYP4G199的转录调控，进而影响东方粘虫表皮的形成。