松材线虫细胞色素P450基因的功能及其分子调控网络研究

Cytochrome P450 genes, which are considered to be the pathogenesis-related genes, play important roles in the pathogenesis process of Bursaphelenchus xylophilus. However, the function of Cytochrome P450 genes and the molecular regulate networks of B. xylophilus are not well characterized. This study will investigate the complete genome sequences from cyp-33C9, cyp-33C4, cyp-33D31 and cyp-13A11 genes by PCR-RACE and bioinformatics analysis. We will use RNA interference to investigate the relationship between the four genes and the growth and development of B. xylophilus. This investigation will allow us to identify the effects of the four genes on the migration and pathogenicity of B. xylophilus and to clarify the function of the four genes in the pathogenesis process. We will also elucidate the roles of the four genes play on the other pathogenesis-related genes of B. xylophilus and draw the microbial metabolic network of the four genes by GenChip technology. This project will provide a scientific basis for the comprehensive understanding of the function of the Cytochrome P450 gene family and the biological control of pine wilt disease.

细胞色素P450基因在松材线虫致病过程中扮演着重要角色，被认为是松材线虫的关键致病基因，但关于松材线虫细胞色素P450基因的功能及其分子调控网络尚不清楚。本项目拟选取松材线虫cyp-33C9、cyp-33C4、cyp-33D31和cyp-13A11基因，通过PCR-RACE技术获得基因的全长序列并对其进行生物信息学分析；借助RNA干扰技术研究四个基因与松材线虫生长和发育之间的内在关联，进一步探究其对松材线虫迁移和致病力的影响，揭示其在松材线虫致病过程中的功能；采用基因芯片技术研究松材线虫细胞色素P450基因对其他致病相关基因表达的调控作用，解析其在松材线虫致病过程中的分子调控网络。项目的实施将为全面揭示P450基因家族在松材线虫致病过程中的功能提供理论依据，对科学指导松材线虫病生物防治具有重要的理论和实践意义。

本项目通过分子生物学手段系统研究了CYP450基因与松材线虫表型、生长、繁殖、迁移和致病力之间的内在关联，分析了CYP450基因对其他致病相关基因表达的调控作用，解析了其在松材线虫致病过程中的分子调控网络，主要结论如下：.（1）成功克隆了松材线虫cyp-33C9、cyp-33C4、cyp-33D3和cyp-13A11基因，构建了带有pEASY-T1干扰载体的Trans1-T1菌株，通过RNA干扰成功抑制了CYP450基因的表达。.（2）CYP450基因dsRNA干扰后对松材线虫体内颗粒物的形成有显著影响；接种至灰葡萄孢第6天，CYP450基因 dsRNA 处理松材线虫的取食面积较小，而对照处理灰葡萄孢菌丝取食殆尽。与对照处理相比，cyp-33C9、cyp-33C4、cyp-33D3和cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的繁殖数量分别下降了17.14、7.44、13.15和4.71倍。.（3）松材线虫CYP450基因dsRNA干扰后，其在黑松树体内的扩散迁移速率受到影响，对照处理在接种第10天后扩散到整株黑松，而CYP450 dsRNA处理则在接种第15天后才扩散至整株黑松；松材线虫CYP450基因dsRNA干扰后，其在黑松树体内的繁殖也受到影响，对照处理在接种第5天后黑松树体内总线虫数量为379条，cyp-33C9 dsRNA、cyp-33C4 dsRNA、cyp-33D3 dsRNA和cyp-13A11 dsRNA处理分别为139,137，,45和127条。.（4）将CYP450基因dsRNA干扰后的松材线虫接种至黑松苗上，发现对照处理黑松针叶全部枯萎，发病率达到100%，而cyp-33C9 dsRNA、cyp-33C4 dsRNA、cyp-33D3 dsRNA和cyp-13A11 dsRNA处理黑松针叶部分枯萎，发病率分别为66.7%，50%，50%和33.3%。.（5）CYP450基因表达沉默后对松材线虫其他基因表达影响显著，筛选出显著差异表达基因数为2521个，表达量上调的基因有1173个。分子调控网络分析表明共有287个松材线虫显著差异表达基因被定位到KEGG 生物学通路，多数基因集中在代谢、生物合成、降解、信号通路、修复等生物学通路。.本项目研究为揭示细胞色素P450基因家族在松材线虫致病过程中的功能提供理论依据。