利用“3i”体系建立山羊胚胎干细胞系及其microRNAs表达谱的研究

Embryonic stem cells(ESCs) have the ability to maintain theirselves self-renewal and pluripotence,without additional growth factors ,only by inhibition of signal pathway which induce ESCs differentiatio,chimera competent ESCs can be derivated. Rencently, a novel derivation system("3i "), including MEK inhibitor，ALK5 inhibitor and GSK3β inhibitor, was successfully used for isolating high germline competent ESCs from NOD mouse and rat, which prevalently were regarded as difficulty in derivating ESCs. Whereas, whether could "3i " system be used for isolating goat ESCs is not clear. In this program, we will use "3i " system to isolate chimera competent goat ESCs firstly. Moreover, microRNAs play an impotant role in ESCs, our interest will focus on compraring goat ESCs and their embryoid body microRNAs profiling. Finally, we will filter goat ESCs specific expressed microRNAs to provide a basic database benefiting study on the function of microRNAs in goat ESCs.

胚胎干细胞(ESCs)自身就有维持自我更新和多能性的能力,应用含有三种小分子化合物的"3i"体系将诱发分化的信号通路抑制，不需要外加维持自我更新和多能性的刺激信号，就可以分离并维持培养ESCs。利用此方法，一些很难分离ESCs的物种成功分离了具有形成嵌合胚胎能力的ESC。山羊是难以分离ESCs的物种之一，本项目拟将"3i"体系应用到山羊ESCs分离培养中，获得具有形成嵌合胚胎能力的ESCs，为ESCs在转基因山羊育种中的应用提供细胞基础。microRNAs在ESCs自我更新和多能性维持，定向分化中起着重要作用，但山羊ESCs的 microRNAs表达谱一直未有报道。因此，在分离山羊ESCs的基础上，本项目将利用深度测序技术绘制山羊ESCs和拟胚体的 microRNAs表达谱，筛选山羊ESCs特异表达的microRNAs,为研究microRNAs在山羊ESCs的调控机制提供基础数据。

应用三种小分子化合物（MEK inhibitor，ALK5 inhibitor和GSK3β inhibitor）的“3i”体系成功从一些本来被认为很难分离ESCs的动物中分离得到了胚胎干细胞（ESCs），但是这一体系能否成功用于建立山羊ESCs是本项目重点研究的问题。通过本项目的研究，在“3i” 分离培养体系中分离山羊ESCs 3株，其中1株传代至第12代。此株细胞表达ESCs特异性标记，自发分化试验证明具有向神经元细胞分化能力。在“2i”分离培养体系(BIO+ PD0325901)中分离山羊ESCs 4株，其中1株传代至第15代。此株细胞细胞表达ESCs特异性标记，体内外分化试验证明其具有向外胚层和内胚层分化能力。通过诱导分化，此株细胞可分化为神经前体细胞，并具有向神经元和神经胶质细胞的分化能力。在“2i”分离培养体系(BIO+ SB431542)中分离山羊XEN细胞2株，其中1株传代至第37代。此株细胞表达XEN细胞特异性标记，维持其生长和干细胞特性依赖于BIO和SB431542。在山羊中，不同小分子抑制剂组合的“3i”或“2i”分离体系分离得到的ESCs样细胞，仅表现出有限的自我更新和多能性能力，反映了调控山羊早期胚胎发育和小鼠早期胚胎发育的信号通路调控差异。特别是在不同的“2i”分离体系(BIO+ PD0325901和BIO+SB431542)中，分别能分离到来源于上胚层 (epiblast) 和下胚层（hypoblast）的山羊primed ESCs和XEN细胞，说明调控山羊ICM分化的信号通路具有不同于啮齿动物的调控机制。本项目所建立的“3i”或“2i”体系为研究调控山羊早期胚胎发育和内细胞团分化的信号调控机理提供了部分线索和良好的体外研究体系。在下一步的研究工作中，将利用“3i”或“2i”体系研bFGF/ERK，TGF-β和经典WNT信号通路对山羊早期胚胎发育和内细胞团分化的影响，确定bFGF/ERK，TGF-β和经典WNT信号通路对山羊早期胚胎发育和内细胞团分化相关基因的调控关系，构建以bFGF/ERK，TGF-β和经典WNT信号通路为主的调控山羊早期胚胎发育的信号调控网络，以揭示山羊早期胚胎发育和内细胞团分化独特的信号通路调控机制。