利用“3i”体系建立人类原始态胚胎干细胞系及其microRNA表达谱的研究

Mouse embryonic stem cells (mESCs) can be defined into naive and primed pluripotent cells depending on the distinct phases of embryonic development from which they were derived. Those cells show different colony morphology, pluripotency, culture conditions for self-renewal, gene expression and epigenetic features. And the two cell types can be interconverted into each other under specific conditions. As human embryonic stem cells (hESCs) are more akin to primed mESCs than to the naive mESCs, they are thought to be derived from later stage of development compared to mESCs. However, whether naive hESCs can be derived from human blastocysts still needs to be further investigated. Based on our results, in this study the naive ESCs will be derived from human blastocysts using 3i culture conditions. Compared to primed hESCs, the colony morphology, pluripotency genes expression, imprinting genes expression and microRNA expression profiles will be investaged.The target genes for naive pluripotency will be identified. The establishing and characterizing of naive hESCs is essential for both developmental mechanism research and clinical application studying.

小鼠胚胎干细胞（ESCs）分为来源于囊胚期内细胞团的原始态(naive)多能干细胞和着床后上胚层的始发态(primed)多能干细胞。虽然人ESCs分离于囊胚期内细胞团，却与小鼠始发态多能干细胞相似。目前尚未有从人囊胚建立原始态ES细胞系的报道。基于我们前期实验结果，本课题拟利用含三种小分子化合物的3i体系从人囊胚建立原始态ES细胞系，比较人原始态与始发态ESCs在多能性分子标记表达、印记基因DNA甲基化及表达和X染色体失活等方面异同，通过基因芯片分析人原始态和始发态ESCs在microRNA 表达谱差异，发现并鉴定维持人原始态ES细胞多能性的关键microRNA,对于表达有显著差异的microRNA，通过双荧光素酶报告基因分析方法，确认其调控的靶基因。本课题将有助于阐明信号通路在维持人原始态与始发态ES细胞作用和调控关系，对人类胚胎发育的研究及ESCs在临床治疗上的实际应用都具有重要意义。

小鼠胚胎干细胞（ESCs）分为来源于囊胚期内细胞团的原始态(naive)多能干细胞和着床后上胚层的始发态(primed)多能干细胞。虽然人ESCs分离于囊胚期内细胞团，却与小鼠始发态多能干细胞相似。本项目利用PD0325901（MEK抑制剂）、CHIR99021（GSK3抑制剂）SP600125（JNK抑制剂）和SB203580（P38抑制剂）四种小分子化合物组成成“4i”体系成功将人类始发态（Primed）胚胎干细胞转化为原始态(Naive)胚胎干细胞系，并且已经稳定传代20代以上，保持正常核型。通过microRNA芯片检测结果显示，人原始态和始发态的ES细胞中microRNA的表达存在差异，通过生物信息学分析，我们找出靶基因是naïve状态基因相关（Nanog, KLF2）的差异表达microRNAs。对于其中几个差异比较明显的microRNAs，hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-135b-5p四个，发现hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-205-5p两者在RT-PCR的结果中也表现出了明显的差异（P<0.01），而hsa-miR-27b-3p（P<0.01）、hsa-miR-135b-5p（P<0.05）则差异较小（P<0.05）hsa-miR-27b-3p在两种细胞状态下的差异无统计学意义。其中，hsa-miR-200c-3p在始发态ES中高表达，而在原始态ES中低表达，hsa-miR-205-5p则正好相反。本项目初步探索了信号通路在维持人原始态与始发态ES细胞作用和调控关系，对人类胚胎发育的研究及ESCs在临床治疗上的实际应用都具有重要意义。. 本项目发表署名基金号的SCI论文11篇，其中影响因子大于5分的5篇，申请发明专利1项，获得广东省科技成果二等奖1项，项目负责人2014年入选“广东特支计划“科技创新青年拔尖人才，2015年入选广州市医学重点人才。