ERK1/2信号在AGEs/RAGE引起糖尿病胃肠平滑肌损伤中的作用及机制研究

Contractile phenotype smooth muscle cells (SMCs) maintain normal gastrointestinal motility. According to documents, advanced glycation end products (AGEs) act through its cell surface receptor, RAGE, and could directly damaged vascular smooth muscle and reduced the number of contractile phenotype SMC in diabetic mellitus (DM). Our previous research found that: in diabetic mice, both of contraction amplitude and frequency of colonic smooth muscle strips reduced; contraction-related ultrastuctures (desmin, dense bodies, macula densa) in SMCs changed; contraction-related proteins （SM α-actin, SM22α, Calponin）reduced significantly. On the contrary, RAGE expression increased markedly. However, the pathology of SMCs in diabetic gastrointestinal has not been clearly elucidated. We hypothesis that: during diabetes development, accumulated AGEs upregulate and activate RAGE on SMCs, which leads to the change of SMCs phenotype from contractile type to synthetic type and(or) apoptosis of SMCs; ERK1/2 signaling pathway and transcription factor serum response factor (SRF) are involved in the injury effect of AGEs on SMCs. The results of SMC injure is impairment of gastrointestinal motility. We would use RAGE knockout mice to research the effect of RAGE/ERKE1\2/SRF axis in AGEs injures on SMCs in vitro and in vivo. Therefore, our study provides a potential target for clinical intervention in diabetic gastrointestinal motility disorders.

胃肠平滑肌细胞（SMC）在收缩表型时维持正常胃肠运动；文献提示，糖尿病（DM）时糖基化终末产物AGEs和受体RAGE可能损害血管平滑肌，使收缩型SMC减少。我们前期工作发现：DM小鼠结肠平滑肌条收缩幅度和频率降低、SMC内与收缩相关的超微结构改变（中间丝、致密斑、致密体紊乱）、收缩相关蛋白基因（SM α-actin、SM22α、Calponin）减少，平滑肌中RAGE表达增加，机制不清。本课题提出：DM病程中大量AGEs、上调并激活SMC表面RAGE、导致SMC表型转换（收缩表型变为合成表型）和凋亡；ERK1/2信号及下游转录因子SRF可能介导该过程，最终使SMC收缩功能受损、胃肠动力障碍。拟采用：RAGE基因敲除小鼠（RAGE-/-），通过细胞模型和动物模型同时研究，探讨AGEs损伤胃肠平滑肌收缩功能过程中，RAGE、ERK1/2和SRF的作用。为DM胃肠动力障碍的防治提出新的调控靶点。

胃肠动力障碍存在于30%～50%糖尿病患者。平滑肌是胃肠运动的执行者，其损伤必然导致胃肠动力障碍发生。但目前糖尿病（DM）结肠平滑肌病变的相关研究甚少。糖基化终末产物（AGEs）参与了糖尿病的众多并发症，且存在于DM大鼠结肠肌层组织。DM胃肠平滑肌发生了何种病变，且AGEs是否参与平滑肌病变尚无研究报道。本研究探讨了AGEs在DM结肠平滑肌损伤中的作用及其机制。主要研究结果：①临床研究发现DM患者结肠肌层中AGEs标志物CML水平显著升高。DM患者结肠平滑肌出现以下超微结构改变：线粒体肿胀、空泡变性；致密斑、致密体数量增加；SMC 细胞膜上腔洞数量明显增加；缝隙连接中断。上述结构均参与SMC收缩过程，因此这些超微结构的改变可能是结肠动力障碍发生的基础之一。此外，糖尿病患者结肠平滑肌标志蛋白SM MHC及SM α-actin表达升高，并与AGEs标志物CML水平呈正相关，说明AGEs可能参与该病理变化。②利用DM动物模型发现DM大鼠的结肠转运功能下降、肌条收缩张力减弱，并伴随结肠长度增加、肌层增厚、平滑肌细胞体积增大这些病理改变。糖尿病大鼠结肠平滑肌标志蛋白水平高于正常对照组，该变化与在糖尿病患者结肠标本中观察到的现象一致。此外，DM大鼠结肠SMC凋亡及凋亡蛋白caspase3、bax增加。但是糖尿病大鼠接受了抗AGEs干预后，上述这些变化均可被改善或逆转。说明AGEs是DM结肠平滑肌病变的上游因素。③为了模拟SMC的在体状态（因为在体SMC均以收缩表型存在），我们运用改良的培养方法，成功建立“收缩型”SMC的培养体系，可以维持SMC的收缩表型。将AGEs作用于“收缩型”SMC，发现AGEs不引起“收缩型”SMC增殖和细胞内ROS 合成。但是AGEs 可促进“收缩型”SMC表达平滑肌标志蛋白，该作用呈浓度和时间依赖性。AGEs的这种作用，主要通过磷酸化p38MAPK，增强myocardin启动子活性，促进myocardin表达，最终上调平滑肌标志蛋白表达水平。此外，AGEs呈剂量依赖性促“收缩型”SMC凋亡。AGEs的这一作用，主要是通过磷酸化p38MAPK、JNK，增加凋亡蛋白Caspase3、Bax表达，最终促“收缩型”SMC凋亡。本研究首次阐明了AGEs在DM结肠平滑肌病变中的作用及其机制，研究成果具有很强的创新性，为寻找DM胃肠动力障碍提供了新的靶点。