胰岛素诱导干细胞因子逆转Cajal细胞介导的糖尿病胃肠动力障碍的新机制研究

Cajal细胞（ICC）异常是糖尿病胃肠动力障碍的重要原因，其形态和功能的维持有赖于SCF-Kit系统。胃肠干细胞因子（SCF）来自平滑肌细胞（SMC）和神经细胞；SMC有胰岛素（Ins）受体，但ICC则无。我们前期研究发现，糖尿病胃肠慢传输动力障碍时，ICC数量结构改变与Ins、SCF呈正相关。现提出Ins可能通过PI3K和/或MAPK信号途径，使SMC产生SCF从而维持ICC形态与功能的假说，拟进行：①培养ICC，予SCF或Ins+SCF，观察外源性SCF和Ins对ICC的作用。②培养SMC，予Ins和Ins受体阻断剂；予PI3K抑制剂+Ins和/或MAPK抑制剂+Ins，探讨Ins通过SMC产生内源性SCF的细胞内途径。③ICC和SMC共培养，予Ins和SCF抗体，观察Ins对SMC和ICC的作用。探讨Ins维持ICC数量结构的通路，为纠正ICC介导的糖尿病胃肠动力障碍提供有益靶点。

本课题完成情况及取得成果主要内容如下：.一、正常及DM大鼠胃肠SMC培养，并以Ins/IGF-1诱导SMC合成内源性SCF：.1、Ins在能显著促进大鼠胃窦、结肠SMC增殖；且Ins呈剂量依赖促进结肠SMC表达SCF。ERK1/2抑制剂（PD-98059）及PI3K抑制剂（LY-294002）均可抑制Ins促结肠SMC合成SCF表达的作用。提示Ins通过ERK1/2及PI3K通路促进SMC合成SCF。.2、IGF-1也可呈浓度依赖促进胃窦、结肠SMC增殖及SCF合成。IGF-1R抗体、PD-98059及ERK1/2 siRNA能阻断SCF的表达，而LY-294002无影响。提示IGF-1诱导胃和结肠SCF表达，依赖于IGF-1R/ERK1/2通路。.3、体外培养糖尿病大鼠结肠SMC生长速度较正常大鼠缓慢，IGF-1也可诱导SCF表达增加，但诱导高峰时间延迟，且也依赖于ERK1/2通路。.二、体外分离、流式细胞术分选、培养并鉴定原代ICC（本课题技术难点），观察外源性SCF对ICC作用：.1、酶法分离小鼠小肠细胞，流式细胞分选术分选ICC，体外培养培养的ICC呈三角形或梭形，核大，核周有少量胞浆，有突起，可与邻近ICC相互连接成网络；ICC间尚可见长梭形，核小，胞浆丰富的SMC，呈峰谷状聚集生长。c-kit及SM α-actin免疫荧光鉴定ICC及SMC，可明显区别ICC与SMC。.2、外源性SCF能促进体外培养的ICC细胞数量增多，细胞间形成更多网络连接，而c-kit mRNA表达无明显差异。.三、建立ICC与SMC共培养体系，观察内源性SCF对ICC的作用：.1、采用Transwell共培养系统成功建立了ICC与SMC共培养体系：共培养体系中ICC与SMC均可正常生长，未出现表型改变。.2、内源性SCF对ICC的作用：添加Ins后， ICC数量增加，c-kit mRNA及SCF mRNA表达增加，提示外源性Ins能诱导SMC产生内源性SCF增多，维持ICC生长。. 本课题现已完成，在课题实施期间，共发表相关论文9篇，其中SCI收录1篇，投稿并被录用美国DDW会议4篇。按照课题要求，标注本课题基金资助的论文5篇，SCI收录1篇（论文的主要内容是本课题的重要结果之一），另1篇已投稿参加2013年美国DDW、并投稿SCI杂志。已培养研究生4名。