基于DNA支架的酶集结效应和逆向代谢工程富集1,4-丁二醇

1,4-Butanediol(1,4-BDO) is a promising C4 compound with wide range of applications, yet its natural biosynthesis has not been reported so far. This proposed project is poised to engineer combinatorial biosynthetic pathway in Escherichia coli. To avoid the buildup and diffusion of intermediates toxic to host cell, a DNA scaffold will be fabricated as a pipeline to bring together a total of five 1,4-BDO biosynthesis enzymes via zinc-finger binding domains, aiming at high substrate conversion rate and remarkable 1,4-BDO formation. To further accumulate 1,4-BDO, the differentially expressed genes between high yield strain and the control strain will be determined by harnessing commercial E. coli chips. Based on E. coli sequence in GenBank and KEGG database, the key enzyme genes affecting 1,4-BDO yield could be precisely addressed to chromosome and graphic catalytic pathways. Upon data analysis, the key regulatory nodes may be recognized. Next, we will apply reverse engineering strategy to reprogramme gene transcription by assigning stronger promoters for up-regulated genes or weaker promoters for down-regulated genes. As a consequence, 1,4-BDO may be further accumulated. Inspired by plant quantitative traits, this study is to unravel the key pathways and crucial regulatory nodes. In addition, this protocol entails the integration of local pathway intensification and reverse metabolic engineering, ensuring ample carbon flux towards 1,4-BDO. This study may not only engineer high yield strain of 1,4-BDO, but also lay foundation for forthcoming modification of other industrial strains.

1,4-丁二醇是具有广泛应用价值的重要化合物，但尚未发现其天然生物合成。本研究拟在大肠杆菌中构建其组合生物合成途径。由于酶催化形成中间产物的积累及扩散极大降低1,4-丁二醇的产量，本研究拟构建DNA支架将关键酶依照催化顺序集结在一起，可望提高底物转化率及1,4-丁二醇产量。为了继续提高产量，利用芯片分析高产菌与对照菌的差异表达基因，然后对其进行KEGG代谢途径定位和染色体定位，据此推断影响产量的关键途径和关键酶，锁定调控节点；采用逆向代谢工程策略调节转录水平，包括改造调控基因，强化上调基因的启动子或弱化下调基因的启动子，可进一步提高产量。本研究借鉴植物数量性状的研究思路，阐明影响1,4-丁二醇产量的关键途径和调控节点这一科学问题。将局部模块途径强化与逆向代谢工程相结合，可充分积累1,4-丁二醇，为微生物分子育种新思路。本研究不仅获得高产菌，而且为其他大宗工业菌种的遗传改造奠定理论基础。

1,4-丁二醇因其特殊的化学结构而成为一种重要化学品，广泛应用于化工、医药、纺织、造纸和汽车等领域。本研究利用蛋白质工程手段进行一系列理性设计及改造，通过降低空间位阻、扩大催化中心及优化催化距离等方式，将一个不可催化1,2,4-丁三醇的丙二醇脱水酶成功的改造为可催化该底物生产1,4-丁二醇的酶；同时，利用代谢工程方法构建了一个木糖高效利用平台菌株，可通过5步反应将木糖转化为α-酮戊二酸，这条通路没有碳损失，理论摩尔得率达到100%。以此为基础，构建了一条全新的、高效的1,4-丁二醇代谢通路，1,4-丁二醇摇瓶产量达到209mg/L。另外，本研究还利用该平台菌株生产了一种高附加值产物，3,4-二羟基丁酸，通过敲除竞争性代谢途径等代谢网络的优化，最终摇瓶产量达到1.27g/L。同时，我们以戊二酸为模板产物，研究了新构建的木糖高效利用平台与大肠杆菌固有木糖利用途径的关系，在生产以α-酮戊二酸为前体的产物时，新的木糖高效利用平台比大肠杆菌固有的利用途径更为高效，而在生产以α-酮戊二酸及乙酰-CoA为前体的产物时，两者的协同效果可以增加目的产物的产量，利用率高于葡萄糖。本研究还探究了葡萄糖与第二碳源的利用方式，构建了新的葡萄糖高效利用平台。我们阻断了葡萄糖的中心代谢途径，以甘油为第二碳源，产生PEP转运葡萄糖，同时生成的PYR则提供细胞生长，该设计巧妙的将多糖的生产过程与细胞的生长偶联起来，实现了两种碳源的协同偶联利用，利用该平台生产海藻糖，摇瓶产量达到8.2g/L。在此基础上，我们构建了葡萄糖及木糖的协同利用平台，实现半纤维素水解物的高效利用，木糖支持细胞生长而葡萄糖作为底物生产海藻糖，摇瓶产量达到5.55g/L。.研究还以合成生物学的思想构建了芳香族化合物的合成平台，通过酶的筛选及途径优化，将一系列酶进行“即插即用”的组合，生产了三种木质素单体及苯酚。另外，我们通过SELEX筛选技术，获得了能与柚皮素结合的RNA片段，构建了新的核糖开关，开发了新的生物传感器。.研究共发表25篇文章，其中本领域TOP文章12篇。