酿酒酵母组合生物合成己二酸的代谢工程研究

Adipic acid is an important bulk chemical and is mainly used for the synthesis of nylon and polyurethane foam. It has a huge market. Efficient total biosynthesis of this compound has not been achieved yet. In this project we intend to construct and validate a novel artificial adipic acid biosynthetic pathway in Saccharomyces cerevisiae. First, the in vivo and in vitro assays will be carried out to screen for efficient enzymes. The initial biosynthetic pathways for adipic acid production will be constructed. The possible bottlenecks of the biosynthetic pathways will be detected using transcriptomics, proteomics and metabolomics tools. The rate-limiting steps in the pathways will be eliminated using protein engineering methods. Then, we will use the strategies of synthetic biology and metabolic engineering to optimize the metabolic pathways and obtain adipic acid overproducing strains. The strategies include: balancing gene expression using modular optimization; building enzyme pipelines using protein scaffolds, reducing the diffusion of intermediates, and improving the reaction efficiency; using anti-sense RNAs to turn down competing pathways and increase the carbon flux through target pathway. In the end, the most advanced technologies, such as genome editing and global transcription machinery engineering will be used to obtain chassis yeast platform for the production of adipic acid and other aromatic compounds.

己二酸是一种重要的大宗化学品，主要用于合成尼龙和聚氨酯泡沫塑料，市场需求巨大，其高效生物合成至今还未实现。本研究拟通过与美国佐治亚大学闫亚军教授合作，以双方的最新研究成果为基础，在酿酒酵母中构建和优化新的己二酸合成途径。首先，通过体内及体外活性测试，对催化每一步反应的酶进行筛选，构建初步的代谢途径。利用组学分析诊断和定位生物合成途径的瓶颈。对于途径中的限速酶采用蛋白质工程手段进行改造。其次，利用合成生物学和代谢工程手段优化代谢途径。优化手段具体包括：通过模块化优化，平衡各个基因之间的表达；利用蛋白支架，构建酶反应的流水线，减少中间产物的扩散，提高反应效率；通过RNA干扰技术抑制竞争代谢途径的流量，提高目标代谢途径的通量。最后，利用CRISPR/Cas9及全局转录机器工程(gTME)等最新技术进行基因组编辑、重排转录网络，最终获得己二酸的高产菌株及适用于高效生产其他芳香族化合物的底盘酵母菌株

己二酸是一种重要的大宗化学品，主要用于合成尼龙和聚氨酯泡沫塑料，全球年需求量超300万吨。针对目前化学合成方法存在产生大量温室气体、环境污染严重且不可持续的问题，本项目开展了己二酸的高效生物合成研究。基于前期设计的三条前体粘糠酸合成途径，从限速酶结构解析及改造、代谢网络调控、基因组高效编辑及驱动力增强等方面开展系统研究。在结构解析改造方面，通过冷冻电镜技术解析了酿酒酵母莽草酸途径关键酶ARO1的三维结构。该酶可催化5步连续反应，是一个复杂的天然分子机器，阐明了各结构域组装及底物传输机理，为构建人工分子机器提高生物催化效率具有指导意义；同时对莽草酸途径及己二酸合成相关的羟化酶、脱水酶等进行了结构解析及改造，实现了二醇脱水酶对1,2,4-丁三醇活性从无到有的突破。在代谢网络调控方面，开发了基于生物传感器和RNA干扰的双功能动态调控策略，摇瓶产量达到1.8g/L；开发了基于群体感应的代谢网络自主调控系统，己二酸前体水杨酸产量达到2g/L，为目前报道的最高产量。在基因编辑方面，开发了基于CRISPR-Cas9的基因编辑工具，仅在10天内即可8个基因的删除。开发了基于辅因子循环和基于生长耦联的驱动力增强策略，同时筛选了中间体的跨膜转运蛋白，大幅提高了产物产量。通过本项目，我们建立了基于莽草酸途径的己二酸高效合成的技术体系，并拓展用于戊二酸、戊二醇、丁二醇等的生物合成，戊二酸产量达到54.5g/L。在Nature Communications、Metabolic Engineering等期刊发表相关文章47篇。